大鼠內(nèi)皮祖
細(xì)胞培養(yǎng)方法
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細(xì)胞描述：
內(nèi)皮祖細(xì)胞是一群異質(zhì)性的細(xì)胞群體，主要起源于骨髓里復(fù)雜的前體細(xì)胞，并以不同的分化階段存在于外周循環(huán)中。因其是能分化為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，因此被命 名為內(nèi)皮祖細(xì)胞。1997 年時，Asahara 等首次利用細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD34 等通過免疫磁珠的方法從人的外周血中成功分離得到內(nèi)皮祖細(xì)胞，并證明其在體內(nèi)有形成血管的能力，隨后于 1999 年證明來源于骨髓的內(nèi)皮祖細(xì)胞能以血管發(fā)生的方式參與出生后的生理與病理性的血管形成。內(nèi)皮祖細(xì)胞的成功發(fā)現(xiàn)徹底改變了人們對于血管形成的認(rèn)識，它能夠選 擇性地歸巢到受損或者缺血部位，參與局部的血管發(fā)生與血管新生，從而形成血管，同時，還能促進(jìn)內(nèi)皮的修復(fù)等。近年來，研究顯示內(nèi)皮祖細(xì)胞具有十分廣闊的應(yīng) 用前景，可用于血管新生、內(nèi)皮再生、心血管病治療、腫瘤的治療、缺血性治療、組織工程、基因治療等領(lǐng)域，因此，簡單、快速、可靠、足量地獲取內(nèi)皮祖細(xì)胞十 分必要。大鼠
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試劑和材料
成年大鼠
血清
Ficoll
M199 基礎(chǔ)
培養(yǎng)基實驗步驟
1、大鼠腹腔注射 0.5 ml 3% 的 C11H17O3N2Na 麻醉致死，浸入盛有體積分?jǐn)?shù) 75% 乙醇的燒懷中消毒 15 min 后移出。
2、無菌條件下取出股骨、脛骨，去除干凈附著于骨表面的肌肉。
3、將獲取的骨頭浸入盛有磷酸鹽緩沖液 PBS 的小燒懷中，用剪刀剪去骨頭兩端的干骺端，暴露出骨髓腔。
4、取一支 10 ml 一次性注射器抽取 6~8 ml 的 M199 基礎(chǔ)培養(yǎng)基沖洗骨髓腔數(shù)次，至骨頭發(fā)白透亮，收集細(xì)胞懸液。
5、取大鼠淋巴細(xì)胞分離液 4 ml 加入 12 ml 的離心管中，傾斜 45 度，再緩緩將細(xì)胞懸液加于淋巴細(xì)胞分離液之上，使其體積比為 1:2,注意保持兩者之間的界面清晰，勿使其彼此混合。
6、將離心管配平后放于
離心機中，離心半徑 12 cm,2000r/min，離心 20 min。
7、緩緩取出離心管，可看到離心管內(nèi)的液體分為 4 層，*下層為紅細(xì)胞與粒細(xì)胞，中間層為淋巴細(xì)胞分離液，*上層為血漿與 M199 培養(yǎng)基，在中間層與*上層之間有一層薄薄的云霧狀層。
8、以移液器直插入云霧狀層，緩緩抽吸；
9、將抽取的液體轉(zhuǎn)移入另一離心管中，然后加入 10 ml PBS 緩沖液，吹打均勻，離心，離心半徑 12 cm,1500r/min，離心 5 min;10、吸棄上清液，取 10 ml PBS 緩沖液，吹打均勻，離心，離心半徑 12 cm，1500r/min，離心 5 min。
11、吸棄上清液，加入 5 ml M199 完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞沉淀吹打均勻，接種于 T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
細(xì)胞傳代及凍存
1、細(xì)胞生長至對數(shù)期，細(xì)胞達(dá)到 80-90% 融合。
2、移除細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS 清洗細(xì)胞 2 次。
3、加入 0.25% 胰酶，37℃ 消化，鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓，完全培養(yǎng)基終止消化。
4、離心，重懸細(xì)胞后重新接種于新鮮培養(yǎng)基中。
5、細(xì)胞不可凍存。
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原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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