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標(biāo)題:蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)
摘要: [蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)]實(shí)驗(yàn)三 蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)一、目的：1．了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要連接方式。2．了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理。3．學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法。二、呈色反應(yīng)：（一）雙縮脲反應(yīng)1．原理：素加熱至180℃左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境中能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱…… [關(guān)鍵詞:蛋白質(zhì) 氨基酸 茚三酮反應(yīng) 呈色反應(yīng) 雙縮脲反應(yīng) 茚三酮 尿素]……
關(guān)鍵詞: 蛋白質(zhì) 氨基酸 茚三酮反應(yīng) 呈色反應(yīng) 雙縮脲反應(yīng) 茚三酮 尿素
蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)
（一）雙縮脲反應(yīng)
1．原理：
素加熱至180℃左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境中能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應(yīng)。可用于蛋白質(zhì)的定性或定量測(cè)定。
反應(yīng)式見（p125）：
雙縮脲反應(yīng)不僅為含有兩個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)所有。含有一個(gè)肽鍵和一個(gè)—CS—NH2，—CH2—NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH或—CHOHCH2NH2等基團(tuán)
NH2 NH2
的物質(zhì)以及乙二酰二胺（O＝C——C＝O）等物質(zhì)也有此反應(yīng)。NH3也干擾此反應(yīng)，因?yàn)镹H3與Cu2+可生成暗藍(lán)色的絡(luò)離子Cu（NH3）42+。因此，一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。
2．試劑：
①尿素 ②10%氫氧化鈉溶液
③1%硫酸銅溶液 ④2%卵清蛋白溶液
3．操作：
取少量尿素結(jié)晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時(shí)，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后，加10%氫氧化鈉溶液約1ml，振蕩混勻，再加1%硫酸銅溶液1滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。要避免添加過量硫酸銅，否則，生成的藍(lán)色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。
向另一試管加卵清蛋白溶液約1ml和10%氫氧化鈉溶液約2ml，搖勻，再加1%硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖。觀察紫玫瑰色的出現(xiàn)。
（二）茚三酮反應(yīng)
1．原理
除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所有α—氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。
β—丙氨酸、氨和許多一級(jí)胺都呈陽性反應(yīng)。尿素、馬尿酸、二酮吡唪和肽鍵上的亞氨基不呈現(xiàn)此反應(yīng)。因此，雖然蛋白質(zhì)和氨基酸均有茚三酮反應(yīng)，但能與茚三酮呈陽性反應(yīng)的不一定就是蛋白質(zhì)或氨基酸。在定性、定量測(cè)定中，應(yīng)嚴(yán)防干擾物存在。
該反應(yīng)十分靈敏，1∶1 500 000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應(yīng)，是一種常用的氨基酸定量測(cè)定方法。
茚三酮反應(yīng)分為兩步，步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個(gè)水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質(zhì)。
反應(yīng)機(jī)理見p127：
此反應(yīng)的適宜pH為5~7，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時(shí)甚至不顯色。
2．試劑：
①蛋白質(zhì)溶液
2%卵清蛋白或新鮮雞蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）
②0.5%甘氨酸溶液
③0.1%茚三酮水溶液
④0.1%茚三酮-乙醇溶液
3．操作：
①取2支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混勻，在沸水浴中加熱1~2分鐘，觀察顏色由粉色變紫紅色再變藍(lán)。
②在一小塊濾紙上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，風(fēng)干后，再在原處滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點(diǎn)的出現(xiàn)。
（三）黃色反應(yīng)
1．原理：
含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步形成橙黃色的硝醌酸鈉。反應(yīng)式見p129：
多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以有黃色反應(yīng)，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)。
2．試劑：
①雞蛋清溶液
將新鮮雞蛋的蛋清與水按1∶9混勻，然后用6層紗布過濾。
②大豆提取液
將大豆浸泡充分吸脹后研磨成漿狀再用紗布過濾。
③頭發(fā) ④指甲
⑤0.5%苯酚溶液 ⑥濃硝酸
⑦0.3%色氨酸溶液 ⑧0.3%酪氨酸溶液
⑨10%氫氧化鈉溶液
3．操作：
向7個(gè)試管中分別按下表加入試劑，觀察各管出現(xiàn)的現(xiàn)象，有的試管反應(yīng)慢可略放置或用微火加熱。待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫下逐滴加入10%氫氧化鈉溶液至堿性，觀察顏色變化。
（四）考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)
1．原理：
考馬斯亮藍(lán)G250具有紅色和藍(lán)色兩種色調(diào)。在酸性溶液中，其以游離態(tài)存在呈棕紅色；當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色。
它染色靈敏度高，比氨基黑高3倍。反應(yīng)速度快，約在2分鐘左右時(shí)間達(dá)到平衡，在室溫一小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。在0.01~1.0mg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度A595nm值成正比。所以常用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
2．試劑：
①蛋白質(zhì)溶液（雞蛋清∶水=1∶９）
②考馬斯亮藍(lán)染液
考馬斯亮藍(lán)G250100g溶于50 ml95%乙醇中，加100 ml85%磷酸混勻，配成原液。臨用前取原液15 ml，加蒸餾水至100 ml，用粗濾紙過濾后，*終濃度為0.01%。
3．操作：
取2支試管，按下表操作
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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