我們知道流式實驗中
抗體標(biāo)記的數(shù)量越多得到的信息就越詳細(xì)和準(zhǔn)確，以此同時，實驗操作也變得更加復(fù)雜。多色流式實驗中的補償操作，一直以來都是流式使用者非常關(guān)心的問題。甚至有人認(rèn)為，由于目前熒光染料的光譜普遍比較寬，可能會在相鄰的多個通道都造成比較大的干擾，因此很難在流式上完成超過 18 色以上的實驗。事實是否真是這樣呢？恰巧哈佛醫(yī)學(xué)院附屬麻省總醫(yī)院的 Dr. Ravi Mylvaganam 與我們分享了他在 6 激光 21 色的 CytoFLEX LX 上做的一個多色實驗。我們一起來看看。
Dr. Ravi Mylvaganam 采用 20 個熒光抗體以及一個
細(xì)胞死活染料組成 21 色的 panel，可同時檢測多群記憶、效應(yīng) T 細(xì)胞，調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞，NK 細(xì)胞甚至是干細(xì)胞樣 T 細(xì)胞等細(xì)胞亞群，詳細(xì)的抗體和染料標(biāo)記如下所示：
實驗樣本準(zhǔn)備步驟：
1. 標(biāo)記一個樣本管，在管中添加 3 µL 以下抗體：
1) CD3 BUV395
2) CD19 BUV496
3) CD56 BUV737
4) CD25 BV605
5) CD95 BV650
6) CD38 BV786
7) CD16 PerCP
8) CD4 PerCP-eFluor710
9) CCR4 PE-TexasRed
10) CCR7 PC7
11) CD8 AF790
2. 添加 25 µL Brilliant Stain Buffer，渦旋混勻 4 秒；然后加入 100 µL 全血，再次渦旋混勻 4 秒后，在 37ºC 下避光孵育 20 分鐘
3. 在試管中添加 5 µL 以下抗體：
1) CD57 Pacific Blue
2) CD45 Krome Orange
3) CD45 RA FITC
4) CCR6 PE
5) CD14 PC5
6) PD-1 (CD279) PC5.5
7) CD27 APC
8) CD127 APC-A700
9) CD28 APC-A750
4. 渦旋混合試管 4 秒后室溫避光孵育 20 分鐘
5. 在管中添加 1 mL VersaLyse 裂解液，渦旋混合 2～3 秒，室溫下避光孵育 15 分鐘
6 樣本 200 g 離心 5 分鐘，棄去上清液
7. 在試管中添加 5 µL IR Fixable 染料，渦旋混合 2～3 秒，室溫下避光孵育 20 分鐘
8. 添加 2 mL PBS 重懸細(xì)胞，200 g 離心處理試管 5 分鐘，棄去上清液
9. 添加 0.9 ml PBS 和 0.1 ml IOTest3 固定液重懸細(xì)胞，可準(zhǔn)備上機檢測
10. 同時按照上述的孵育、離心操作制備單染管
實驗結(jié)果如下
從實驗結(jié)果圖可以看出，這個 21 色方案的結(jié)果分群清晰，不論是常規(guī)的 CD3+CD4+Th 細(xì)胞還是含量較低的 Treg 或者干細(xì)胞樣 T 細(xì)胞，都能很好的檢測到，看來對于 CytoFLEX LX 而言，21 色實驗也不是一個難題。如果您需要該方案詳細(xì)的信息，可與我們聯(lián)系。
多色補償問題的簡化，與流式細(xì)胞儀技術(shù)的發(fā)展密切相關(guān)。遙想小編當(dāng)年，那個流式細(xì)胞儀用完后還要用紅布蓋起來的年代，我剛開始接觸的是一臺 4 色的流式，當(dāng)時 4 色實驗就是「多色」實驗了！那時沒有離線補償也沒有自動補償，流式也沒做得那么頻繁，調(diào)補償是相當(dāng)刺激的操作：先在 17 寸顯示屏上畫滿所有通道兩兩對應(yīng)的散點圖，上樣之后一定要眼疾手快反應(yīng)迅速默念「橫平豎直」，如果相關(guān)的門沒圈好，或者看到補償矩陣腦子蒙圈不知道調(diào)哪里，一著急就手足無措，經(jīng)常一管單染管跑完補償還沒調(diào)好所以實驗前師兄師姐往往要提醒「單染管多準(zhǔn)備點樣本」……
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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