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一、細胞：

1.選擇適當?shù)募毎�接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細胞數(shù)呈的線性關系。否則細胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。

2.藥物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結(jié)果再定個比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。

3. 時間點的設定。在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，*后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點應該就是的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制表現(xiàn)的*明顯）。

4.培養(yǎng)時間。200 ul的培養(yǎng)液對于10的4～5次方的增殖期細胞來說，很難維持68 h，如果營養(yǎng)不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48 h換液的。

5.MTT法只能測定細胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細胞絕對數(shù)。做MTT時，盡量無菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。

6.理論未必都是對的。要根據(jù)自己的實際情況調(diào)整。

7.實驗時應設置調(diào)零孔，對照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。

二、實驗步驟：

貼壁細胞：

1.收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調(diào)密度至1 000-10 000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。

2.5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100 ul，設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況，3.5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

4.每孔加入20 ulMTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。

5.終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。

6.每孔加入150 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值。

三、懸浮細胞：

1）收集對數(shù)期細胞，調(diào)節(jié)細胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a足的1640（無血清）培養(yǎng)基40 ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10 ul用培養(yǎng)液稀釋1 ug/ml，需預試尋找*佳稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測物10ul；④細胞懸液50 ul（即5×104cell/孔），共100 ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100(儲存液100 1640）。

2）置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570 nm（630 nm校準）測量各孔的吸光值）

4）離心（1000轉(zhuǎn)x10 min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570 nm（630 nm校準）測量各孔的吸光值。

四、MTT的配制：

MTT一般現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4oC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5 mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。

MTT有致癌性，用的時候小心,有條件帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉。

配制MTT時用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。

五、關于細胞的接種(鋪板)：

細胞過了30代以后就不要用了,因為狀態(tài)不好了;培養(yǎng)板要用好的（進口板），不好的板或重復利用的板只可做預實驗。

接種時按照預實驗摸索出的密度接種, 因為細胞密度在10 000/ml左右時，所測得的OD值的區(qū)間即細胞抑制率（或者增值率）的所呈現(xiàn)的線性關系，結(jié)果*可信。如果鋪的太稀細胞的殺傷不會很明顯，太密細胞可能都會凋亡，因為細胞長的太快營養(yǎng)會不夠，*后導致死亡。且而細胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關系不佳。故而MTT細胞密度多采用10 000/ml，100 ul/孔。

細胞密度要根據(jù)不同細胞的特點來定.如果你做的藥品對細胞具有刺激作用那么取小點的細胞濃度，如果你做的藥品對細胞具有抑制作用那么取大點的細胞濃度，這樣與對照的區(qū)別更明顯，數(shù)據(jù)更好。懸浮細胞每孔的細胞數(shù)可達到105，貼壁細胞可為103-104。

1.首先細胞的接種密度一定不能過大，一般每孔1 000個左右就夠了，我認為寧少勿多。尤其是對于腫瘤細胞。10 000/孔是太高了，這樣即使藥物有作用，MTT方法也是表現(xiàn)不出的，*佳點板濃度在4 000-5 000/孔，太少的話SD值會很大。

2.MTT本身就是比較粗的實驗，增殖率10%左右的波動都不算奇怪。特別是新手，20%的波動也是常見的，所以很可能是技術(shù)原因引起的，特別是種板技術(shù)一定要過關。

3.我做的是腫瘤細胞的MTT實驗,這種細胞長的很快一開始我是用100 000/ML的濃度來接種的,結(jié)果細胞長的太滿結(jié)果是沒有梯度也沒有線性關系.后來調(diào)整濃度,用過40 000~80 000/ML的濃度都做過MTT實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)做的結(jié)果比較好點的是60 000~70 000/ML的濃度組的.用40 000/M的濃度的組,由于細胞少,藥物作用的梯度還是有,只是沒有很好的線性關系.還有根據(jù)細胞生長速度以及藥物的特性(有時間依賴性和濃度依賴性的藥物)來確定培養(yǎng)時間是48小時還是72小時。

注意細胞懸液一定要混勻，已避免細胞沉淀下來，導致每孔中的細胞數(shù)量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。雖然移液器比移液管精確得多，但是如果操作不熟，CV會在8%左右。另外，吹散次數(shù)過多也會影響細胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。

首先說說我的一點經(jīng)驗：

1.吹打時懸液總量不能太多，達到吸管吸液量的3到4倍，可能比較容易混勻。10 ml的離心管里面裝3~4 ml的懸液：懸液太少容易吹起很多氣泡，懸液太多又不容易吹成單細胞懸液。

2.吸管的吸液量在1 ml左右：吸液量過多的話，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過少，吹打的力度就不夠，吹打就會不均勻。如果是吸液量1 ml多的吸管，總液量在5ml左右為益。

3.吸的時候要在懸液底部，然后提起來一點，但是吹下去的時候不要離開液面，否則容易吹打出氣泡。

4.吹打次數(shù)100左右，就可以吹打均勻了（有人認為加細胞前吹打30－50次基本就差不多均勻了。加細胞的時候每接種2孔反復吹打3次，每吹打3次后槍頭垂懸與細胞懸液中5秒鐘，然后再以一定的速度吸取懸液。）

六、加入MTT：

個人認為MTT*關鍵的是你的細胞數(shù)目和你加入真正起作用的的MTT的適當比例，具體細胞數(shù)目和真正起作用的的MTT之間的關系確實不好確定，我認為MTT多加一些比少加好一些。

MTT的量各家報道不同，一般是過量的，所以10 ul即夠了。如果不使用96孔板，培養(yǎng)基超過100 ul，MTT按照10%的比例加入，加入MTT以后振蕩一下讓MTT與培養(yǎng)基混勻，不過這個應該關系不大。

如加入MTT后都有個別孔立即變?yōu)樗{黑色，則污染的可能性極大，另外MTT稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜，且在加MTT前可以先在鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的。

七、如何清除上清：

百家爭鳴：

1.加DMSO前要把液體吸掉，但培養(yǎng)液里的紫色結(jié)晶可能會吸去，可在這之前先用平板離心機離心96孔板，2 000 r，5分鐘，然后吸掉上清(如果是懸浮細胞，則推薦此法,懸浮細胞要離心2500 rpm×10 min，且其做MTT用圓底型96孔板,清除上清時注意不要把下面的結(jié)晶顆粒吸掉,建議各孔吸棄150-160 ul即可)。

2.我每次將MTT加入后，再孵育四個小時，然后用離心機離心1 000G，5 min。但是用槍小心地吸上清，還是會將一小部分藍色結(jié)晶吸出。所以還是建議翻轉(zhuǎn)倒扣的方法吧！

3.另外，可以直接將板翻轉(zhuǎn)倒扣（墊幾層濾紙）2－3次，比用“吸”的辦法更不容易使細胞脫離出來�？梢暂p拍，或者傾斜一點幫助吸液，發(fā)現(xiàn)紫色結(jié)晶幾乎沒有肉眼可見的掉脫，但前提是你本身細胞貼壁要比較牢，半貼壁生長的細胞容易脫離。假如藥物作用時間長的話，陰性對照組可能由于細胞過多而使加入ＭＴＴ后形成的結(jié)晶漂起來，這樣就不能直接倒掉上清。

4.做MTT時，這一步驟一定要小心，不要采用倒的方式。因為貼壁不牢的細胞會被倒掉，從而影響OD值。懸浮細胞，不要翻板，離心后也不要翻板，這個方法害死人。

5.加完MTT反應3－4 h后，從培養(yǎng)箱取出96孔板的動作要輕柔，避免振蕩結(jié)晶,使其滑落.你可以試著將96孔板傾斜30度角，然后用槍尖慢慢吸，有的細胞可以用排槍一起吸，有的則要耐心的一個個用槍頭吸，槍尖的力度和方向要保證每個孔都一致。不要讓槍頭接觸到孔底，且一旦傾斜孔板后就不要反復傾斜放平，這樣也會使結(jié)晶脫落。

八、避免清除上清而改進的方法：

由于一般可離心96孔板的離心機不好找。既使是貼壁細胞做MTT時，用DMSO溶解得到結(jié)果也不好，不是得不到預期結(jié)果就是可重復性差。

解決方法1:

用以下文獻方法：周建軍等，評價抗癌物質(zhì)活性的改良MTT方法，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1993，24（10）：455-457

具體方法：

配三聯(lián)溶解液：10%SDS，5%異丁醇，0.012 mol/LHCL，蒸餾水溶解。

操作：在培養(yǎng)板上加一定密度的細胞懸液，90 ul/孔；如需給藥，則再于同時(懸浮細胞)或4h后(貼壁細胞)加入不同濃度的藥物10ul/孔，均設三復孔。另外，每塊板上另沒一個調(diào)零孔(只加培養(yǎng)液，不含細胞和藥物)。培養(yǎng)2 d后，加入MTT溶液20 ul/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后加入上述三聯(lián)液100 ul/孔，于37度放置過夜后，用酶標儀測各孔A570值。

優(yōu)點：簡化操作，提高了可靠性。

就是比較貴，如果經(jīng)費充足，用這個是不錯的。

4、在450 nm波長處測定吸光度，參比波長為600 nm或600 nm以上。

九、加入DMSO：

在同一批實驗中不要更換DMSO。加DMSO前把孔中液體盡量棄干凈，沒有去掉上清直接加DMSO，一是沉淀會很難溶解.二培養(yǎng)液的顏色在檢測時也能被測到,會對*后結(jié)果造成影響。但前提是不能把細胞也一起吸掉，因為這樣帶來的誤差要遠遠大于培養(yǎng)液沒棄干凈帶來的誤差,所以要在保證細胞不被吸掉的前提下，盡量把培養(yǎng)液吸掉。如果培養(yǎng)液沒棄干凈，空白孔也要留有等量的培養(yǎng)液，這樣在檢測時可以盡量去除培養(yǎng)液的影響，DMSO的量也可為100ul或150ul。

1.加了DMSO后用振蕩器輕輕振蕩5－10min, 時間控制盡量嚴格一點,放置時間長了會影響結(jié)果,值會偏大,且結(jié)果不可信。

2.加入DMSO后可用排槍反復抽吸助溶，溶解后盡快檢測。如果實驗孔不多，建議用此法，因其比振蕩溶解效果好。

3.或放入37度放孵箱15分鐘溶解結(jié)晶。

十、OD值的測定：

至于測定波長的選擇是因顯色溶液而異的，對于DMSO，溶解后呈紫（紅）色，490 nm有吸收值，而ATCC公司的MTT試劑盒用的不是DMSO，它的測定波長是570。(就如ELISA實驗選用OPD作底物測定波長是492，選用TMB顯色液則用450)；而對于SDS和酸化異丙醇，則選用570 nm，并且建議以655nm作為參考波長。

DMSO溶后10分鐘內(nèi)測，越放顏色越深，而SDS做為溶解液測吸收光值，其值可在三天內(nèi)保持不變。

細胞密度偏大測出的吸光度也會偏大，細胞密度小吸光度也會偏��；另外跟細胞狀態(tài)也有關系，細胞狀態(tài)不好的話，吸光度值也會低的；細胞數(shù)目少，或者是培養(yǎng)的時間短，OD值也會偏低。如果各個孔的孔間差異性特別明顯的話說明有可能存在污染,空白孔的OD值太高，很可能是細菌污染。

復孔直接的OD值差別一般應在0.1－0.15，差別太大考慮：1.接種細胞數(shù)不均勻，或是接種太多，應保證每孔一致，一般是每孔1 000－10 000個。可以細胞細胞計數(shù)后，加入細胞懸液，再補培養(yǎng)基到預定體積，并輕輕吹打幾次，使細胞均勻分布，這樣比直接加入預定體積的細胞懸液要好，接種時應加含血清培養(yǎng)基。2.貼壁時間：18－24 h，如果不夠，未懸浮的細胞會被吸掉。

一般為了實驗的準確，每個濃度可以設5－6個復孔，可以*后統(tǒng)計時，可以除去一個值和一個值，或者除去其中數(shù)據(jù)離譜的值，這些離譜數(shù)字的出現(xiàn)與細胞是否污染，細胞是否在培養(yǎng)期間死去，是否培養(yǎng)液蒸發(fā)過多，加MTT液是否準確，在37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育時間是否一定（1－4小時）等有密切的關系，當然測定OD值的儀器工作狀態(tài)是否正常也非常重要！(一般開機預熱20 min)。

MTT方法的吸收度在0.2～0.8之間誤差較小。這和分析化學中的lambert-beer定律有關， 對朗伯-比爾定律的偏離在吸光光度分析中，經(jīng)常出現(xiàn)標準曲線不呈直線的情況，特別是當吸光物質(zhì)濃度較高時，明顯地看到通過原點向濃度軸彎曲的現(xiàn)象（吸光度軸彎曲)。這種情況稱為偏離朗伯-比爾定律。若在曲線彎曲部分進行定量，將會引起較大的誤差。在吸光光度分析中，儀器測量不準確也是誤差的主要來源。任何光度計都有一定的測量誤差。這些誤差可能來源于光源不穩(wěn)定，實驗條件偶然變動，讀數(shù)不準確等。

在光度計中，透射比的標尺刻度均勻。吸光度標尺刻度不均勻。對于同一儀器，讀數(shù)的波動對透射比為一定值；而對吸光度讀數(shù)波動則不再為定值。吸光度越大，讀數(shù)波動所引起的吸光度誤差也越大透射比很小或很大時，濃度測量誤差都較大，即光度測量選吸光度讀數(shù)在刻度尺的中間而不落兩端。待測溶液的透射比T在15%~65%之間，或使吸光度A在0.2~0.8之間，才能保證測量的相對誤差較小。當0.434(或透射比T=36.8%)時，測量的相對誤差*小。

其它的聲音：

1.用570 nm波長的濾光片，因為MTT在這個波長的吸光度是峰值，換句話說靈敏度高。用其它波長的也有，一般是490 nm，但我的經(jīng)驗靈敏度降低一半。

2.我們用的BIO-TEK公司的ELx800，一般值在2以下都是可靠的,如果復孔之間值相差太大就要考慮是否是實驗過程中的誤差，我曾經(jīng)看到園子的有些帖子報道說OD值大概在0.2-1.2范圍內(nèi)與活細胞數(shù)有較好的線性關系，但OD值在0.3-0.9范圍內(nèi)可能更佳，若你的OD值不在這個范圍內(nèi)則你實驗的細胞數(shù)可能不太合適，應調(diào)整你的細胞數(shù)。

邊緣效應

十一、關于如何計算IC50：

Pn:*小陽性反應率

舉個例子：各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數(shù)為10，濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。

代入計算公式：

十二、結(jié)果統(tǒng)計學處理：

所有數(shù)值以x±s表示，應用SPSS軟件進行方差分析，p<0.05時為相差顯著，p<0.01時為相差非常顯著�？梢砸詴r間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生線，專門公式求IC50�；蛴嬎阋种坡�。細胞死亡率%=OD對照組-OD實驗組/OD對照組

excel表中可以做兩兩比較的T-test，這個你可以參考一下；你的數(shù)據(jù)應該用多個樣本均數(shù)的T-test，方差分析也可。用的軟件是SPSS或者SAS。

強烈建議培養(yǎng)板不要重復使用:1、泡酸是可以，但是泡完酸的板子很不利于細胞的生長，會出現(xiàn)帖壁不好，細胞生長緩慢等情況.2、這樣的板子消毒滅菌很不徹底，如果有萬一,則因小失大.3、重復用的板子洗不干凈在培養(yǎng)過程中易出現(xiàn)雜質(zhì)。

洗凈后用2% NaoH浸泡4小時，再用1％稀鹽酸浸泡4小時，沖洗15遍，蒸餾水沖洗3遍，烘干，UV照射過夜(紫外2小時以上消毒即可)

泡酸2－4小時，老師讓我們別超過4小時，（普通的玻璃儀器是過夜）。撈出，沖洗干凈，烘干后，UV 照射過夜。估計跟其他收集在一起，鈷60照射消毒.

1.做完MTT后用大水流盡量將板沖凈，然后用洗衣粉水泡幾個小時（小心讓洗衣粉先化開）。2.用自來水沖凈洗衣粉水，倒扣晾干.3.重鉻酸鉀加濃硫酸配成的酸液中浸泡過夜泡洗液(六小時以上即可)后自來水洗凈（20次左右）每個孔都要處理。4.用去離子水沖洗3遍，雙蒸水沖洗3遍，烤干。5.超凈臺中紫外線照射2個小時左右，就可以用了，不可以高壓。

5、做實驗前，96孔板至少在紫外燈下照射30分鐘，但不能長期照射。紫外線長期照射可使板變黃，我的兩塊板放在超靜臺上忘了拿出來，一直照了兩個星期，等我從超靜臺上取出板已經(jīng)變成黃色。

原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司