哺乳動物的大腦由數(shù)十億個神經(jīng)元組成，這些神經(jīng)元通過不同的回路連接在一起，而每個回路都參與了特定的生理功能。為了更好地了解這些不同的神經(jīng)元和回路如何與心理活動和疾病相關(guān)聯(lián)，研究人員正在重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的三維圖。
然而，哺乳動物大腦的3D成像是一項很有挑戰(zhàn)性的工作。光在穿過各層組織時會被水、脂質(zhì)和
蛋白質(zhì)等各種分子散射，這會大大降低圖像分辨率。于是，研究人員從組織中去除水和脂質(zhì)來減少散射，同時引入化學(xué)物質(zhì)讓生物組織變得透明。
2013年，哈佛大學(xué)的Karl Deisseroth及其團隊開發(fā)出的CLARITY水凝膠技術(shù)轟動了全世界。這項技術(shù)使研究人員能夠用熒光標記物標記小鼠神經(jīng)組織中的神經(jīng)元，然后在不切片的情況下對整個小鼠大腦進行成像，同時保留熒光信號。
自那時起，研究人員不斷開發(fā)出能夠更好地保留組織結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化合物，讓組織透明化技術(shù)不斷得到改善。*近，《The Scientist》雜志介紹了組織透明化方面的一些新技術(shù)，有助于實現(xiàn)高分辨率的大腦成像。
與脂質(zhì)兼容的透明化方法
研究者：華中科技大學(xué)，朱丹
許多組織透明化方法都會利用有機溶劑或去垢劑來降解
細胞膜的脂質(zhì)，同時采用脂質(zhì)染料來染色神經(jīng)元和細胞器。朱丹及其團隊于是開發(fā)出一種稱為RTF的方法，與脂質(zhì)染料兼容（Sci Rep, 8:1964, 2018）。
RTF是一種包含水、甲酰胺和三乙醇胺的
溶液。早前，另一個實驗室無意中發(fā)現(xiàn)甲酰胺能夠讓組織變得透明。一些研究表明，甲酰胺很有可能讓蛋白質(zhì)部分變性，降低其折射率并使其更接近水和脂質(zhì)，從而創(chuàng)建了折射率更均勻的環(huán)境。
朱丹領(lǐng)導(dǎo)的研究團隊發(fā)現(xiàn)，利用RTF讓小鼠大腦變得透明之后，內(nèi)源蛋白的熒光信號沒有被淬滅，另一種廣泛用于軸突染色的脂質(zhì)染料Dil的信號也沒有被淬滅。其他技術(shù)大約需要一周的時間讓組織變得透明，而RTF只需要一天的時間。這個過程也是可逆的，將組織浸泡在鹽水中，透明的組織可以恢復(fù)到原始狀態(tài)。
不過，RTF不適用于厚度超過1毫米的成年小鼠腦組織。透明化的組織還存在2%到5%的收縮，這會降低組織結(jié)構(gòu)成像和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的準確性。此外，
抗體滲透到透明化組織的速度會減慢，今后他們打算解決這個抗體減速問題，從而進一步減少組織處理時間。
小貼士：為了優(yōu)化組織的透明度，朱丹教授建議調(diào)整其實驗方案中的處理時間。盡管RTF并未在市場上銷售，但這些試劑價格便宜，可以自行配制。她認為，透明化過程比其他大多數(shù)組織處理技術(shù)更簡單。
讓硬組織和軟組織都變得透明
研究者：德州農(nóng)工大學(xué)，Hu Zhao
現(xiàn)有的透明化方案并未同時針對大腦和脊髓等軟組織以及鈣化的硬組織（比如骨骼）進行優(yōu)化。這使得人們難以觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)之間的完整連接，因為脊髓中的周圍神經(jīng)連接到椎骨，而椎骨不透明無法成像。
Zhao及其團隊開發(fā)出一種名為PEGASOS的方法，可讓軟組織和硬組織同時變得透明（Cell Res, 28:803–18, 2018）。它的不同之處在于使用聚乙二醇（PEG）來增強熒光信號，并增加了兩個步驟：硬組織的脫鈣和有色組織（如肝臟）的脫色。處理方法有兩種：將組織浸泡在溶液中；或用灌注泵將溶液泵到全身。
他們利用PEGASOS方法來追蹤大鼠脊柱兩個不同節(jié)段之間的軸突，并觀察脊髓內(nèi)的神經(jīng)元，而無需通過手術(shù)將它們與椎骨分開。他們還發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)集中在某些骨骼區(qū)域內(nèi)。不過，PEGASOS的處理會導(dǎo)致組織收縮30%到40%，這可能會使組織結(jié)構(gòu)變形。
對于浸泡的組織，透明化過程大約需要7-12天。整個生物體的透明化顯然需要更長的時間，因為透明化溶液必須循環(huán)處理10天，這樣年幼大鼠的透明化時間大約為三周，而成年大鼠的循環(huán)時間還要加倍，因為它們的組織更多。未來，研究人員打算解決組織收縮的問題，并減少與之相關(guān)的自發(fā)熒光。
小貼士：組織透明化只是萬里長征的步，而隨后的成像和數(shù)據(jù)處理則更具挑戰(zhàn)性。Zhao博士建議新用戶不要一開始就處理整個器官，而是從薄薄的組織切片開始，以便熟悉整個流程。這項技術(shù)使用的試劑都是現(xiàn)成的，他估計整個小鼠大腦的透明化成本大約為30美元。
不但透明，而且放大
研究者：東京大學(xué)，Hiroki Ueda
現(xiàn)有的大多數(shù)大腦透明化技術(shù)都無法使組織變得完全透明，因此很難以單細胞分辨率構(gòu)建大腦圖像。東京大學(xué)的Ueda及其同事在篩選了將近1,700種化學(xué)物質(zhì)后，開發(fā)出一種名為CUBIC-X的方法，不僅可讓腦組織變得透明，而且還能膨脹數(shù)倍（Nat Neurosci, 21:625–37, 2018）。
他們將組織浸沒在親水性試劑中，使大腦的體積膨脹約十倍。利用這種操作，Ueda及其同事能夠?qū)穸葹?厘米的小鼠大腦進行成像，而不會丟失任何細胞。此外，由于膨脹的組織中大約99％是水，因此整個大腦各層的折射率幾乎保持不變。這會使組織變得透明，并使得單細胞成像的光透射率接近100％。
不過，這種讓組織膨脹的化學(xué)物質(zhì)往往會淬滅神經(jīng)元和RNA標記的熒光信號。利用CUBIC-X讓整個小鼠大腦變得透明，大約需要16天。下一步，Ueda希望將這種技術(shù)應(yīng)用在其他器官，包括心和肺。
小貼士：研究人員創(chuàng)建了開放獲取的小鼠大腦地圖集CUBIC-Atlas。用戶可將其數(shù)據(jù)與這個地圖集進行比較，評估大腦透明化處理的重復(fù)性。CUBIC-X試劑現(xiàn)已上市（Tokyo Chemical Industry），25 mL的售價為50美元，足夠處理一只小鼠的大腦。
保護功能出色的SHIELD方法
研究者：麻省理工學(xué)院，Kwanghun Chung（CLARITY技術(shù)的開發(fā)者）
在組織透明化的過程中，人們往往利用酶和化學(xué)物質(zhì)來消化組織，去除脂質(zhì)，有時還會讓樣品脫水。這個過程不可避免地會降解蛋白質(zhì)和RNA，破壞關(guān)鍵的分子信息，還會淬滅熒光信號。Chung及其同事采用一種稱為聚環(huán)氧化物的材料來解決這個問題。
研究人員篩選了六種環(huán)氧化物，并通過計算機模擬來確定哪種能地保留綠色熒光蛋白（GFP）的熒光。然后，他們將選定的環(huán)氧化物注入轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織中，這些小鼠的神經(jīng)元表達GFP。在那里，環(huán)氧化物與GFP發(fā)生反應(yīng)，形成柔性化學(xué)鍵。這些鍵能夠避免GFP在透明化過程中變性，并允許GFP在處理后重新回到其天然構(gòu)象。
Chung及其同事表明，這種名為SHIELD的方法可保持熒光蛋白的信號，保護內(nèi)源性蛋白質(zhì)和RNA的結(jié)構(gòu)，并降低自發(fā)熒光（Nat Biotechnol, 37:73–83, 2019）。它可以保留蛋白質(zhì)與抗體結(jié)合的能力，以及RNA轉(zhuǎn)錄本與探針結(jié)合的能力。
整個小鼠大腦的SHIELD處理大約需要四天。隨后的組織透明化還需要四到六天，故整個過程總共需要兩周。下一步，研究人員計劃將SHIELD用于更大的器官甚至腫瘤。他們還開發(fā)出一種改進的系統(tǒng)，可促進抗體對組織的滲透，從而加快標記速度。
小貼士：組織經(jīng)過SHIELD處理后會變得較硬，延緩抗體滲透的速度，因此整個小鼠大腦的抗體標記時間須延長兩天。SHIELD已上市，可聯(lián)系Life Canvas Technologies購買。一個500毫升的
試劑盒售價為1,000美元，能夠處理大約16只小鼠的大腦。
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
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