原理：在受體細胞經(jīng)過
化學(xué)試劑或者電擊處理等方法處理后，受體細胞的膜通透性發(fā)生改變，
質(zhì)粒DNA或者以其為載體的重組DNA分子，進入到細菌體內(nèi)而實現(xiàn)擴增。
感受態(tài)細胞：是指細胞自然或者經(jīng)過誘導(dǎo)處于容易吸收外源DNA的一種生理狀態(tài)。在基因工程中，用于轉(zhuǎn)化的受體菌（Restriction-Modification 缺陷變異株，以防止對導(dǎo)入外源DNA進行切割）一般通過誘導(dǎo)的方式實現(xiàn)。主要原理就是通過處理使細胞的通透性變大，直觀的說，使得細胞膜表面出現(xiàn)一些孔洞，便于外源基因或載體進入感受態(tài)細胞。由于細胞膜的流動性，這種孔洞會被細胞自身所修復(fù)。
質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化主要包含
Ⅰ感受態(tài)細胞制備
Ⅱ質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化
Ⅲ質(zhì)粒DNA的提取
（Ⅰ）感受態(tài)細胞制備
1）從新活化的大腸桿菌（常用DH5a）平板上挑取一個單菌落，接種于3ml LB
培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
2）將該菌懸液按照1:100轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，100ml，37℃振蕩擴大培養(yǎng)，2~3h。當(dāng)培養(yǎng)液開始渾濁時，間段性測試OD600，在數(shù)值為0.3-0.5時停止培養(yǎng)。
3）培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)移到離心管中，冰上放置20min，0℃-4℃離心10min（4000r/min）。
4）棄掉上清，管口倒置以便培養(yǎng)液棄除干凈。
5）加入0.1mol/L冰冷的氯化鈣
溶液30ml，小心懸浮沉淀細胞，冰浴30min。（氯化鈣的濃度和純度非常重要，不同批次不同廠家的產(chǎn)品均可影響感受態(tài)轉(zhuǎn)化率）
6）4℃離心10min（4000r/min）。
7）棄掉上清，用0.1mol/L氯化鈣2ml冰浴懸浮細胞（冰上放置）片刻，感受態(tài)細胞制成。
8）可直接用于實驗，4℃保存。也可分裝長期保存，加入總體積15%的滅菌甘油，-70℃條件下保存。
（Ⅱ）質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化
1）取100ul新鮮制備的感受態(tài)細胞，加入質(zhì)粒1ul DNA混勻,同時設(shè)置對照組（未加質(zhì)粒，未加受體菌，已知具有轉(zhuǎn)化活性的DNA）。
冷凍的感受態(tài)細胞要在冰上解凍，待管中*后一點冰融化后，迅即加入DNA. 解凍感受態(tài)細胞溫度高于0℃，會降低轉(zhuǎn)化效率。
2）冰浴30min，離心管放到42℃保溫90s（不要搖動離心管）。冰浴時間短于30min ,可能影響轉(zhuǎn)化率。然后迅速冰浴2min。
3）向離心管加800ulLB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h（150r/min）。37℃生長1小時能夠?qū)τ诩毎謴?fù)和抗生素抗藥性表達具有*佳效果。
4）取適當(dāng)（50ul）的復(fù)蘇
細胞培養(yǎng)液，涂布在含抗性的選擇性培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，正置30min。等菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12~16h，出現(xiàn)菌落。
5）菌落結(jié)果：
① 無菌落
失敗或者培養(yǎng)條件不充分
② 布滿菌落,
呈苔樣，失敗�？赡苁强股貪舛炔粔蚧蚴 ３霈F(xiàn)大菌斑，大多是由于霉菌污染所致
③ 布滿菌落
濃度太高，失敗
④ 出現(xiàn)菌落
符合要求
Ⅲ）質(zhì)粒DNA的提取
質(zhì)粒DNA的提取，由于其本身分子量小，一般采用堿裂解法提取。目前已研發(fā)出多種質(zhì)粒提取
試劑盒，實驗操作簡單，只需按照產(chǎn)品操作說明操作即可。不過對于其中主要試劑和作用的理解，能夠避免實驗過程中的一些問題，或者能夠geng好的解決問題。
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
客服一
