如何選擇適合的細胞增殖檢測方法_技術文章

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如何選擇適合的細胞增殖檢測方法
閱讀次數(shù)：319 發(fā)布時間：2020/11/18 9:09:04

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細胞增殖檢測的應用相當廣泛，不論是測試藥物試劑還是生長因子的效果，不論是評估細胞毒性還是分析細胞活性狀態(tài)，您都可能會用到它。細胞增殖檢測一般是檢測分裂中的細胞數(shù)量或者細胞群體發(fā)生的變化。細胞增殖檢測主要分為四類：DNA合成檢測、代謝活性檢測、細胞增殖相關抗原檢測和ATP濃度檢測。在這些方法中作何選擇，主要取決于您所研究的細胞類型和研究方案。

DNA合成檢測

DNA合成檢測是目前實驗室中檢測細胞增殖*準確可靠的方式。傳統(tǒng)方法是，將放射性標記的3H-胸腺嘧啶與細胞一同孵育幾小時或者孵育過夜。這樣新增殖細胞的DNA中就會摻入放射性標記，經(jīng)洗脫后可用閃爍計數(shù)器SC檢測。該方法時間耗時長而且還有個明顯的弊端，那就是使用和處理放射性物質(zhì)既麻煩又不安全。不過，您還可以使用5-溴-2-脫氧尿苷BrdU來進行類似實驗，因為BrdU也同樣可以摻入到新合成的DNA中。不過這樣就需要進行額外的實驗步驟，先孵育特異性BrdU單抗和帶標記的二抗，然后再進行比色法、化學發(fā)光檢測或熒光信號檢測等步驟。該方法的好處就是讓您不需要再和放射性物質(zhì)打交道。BrdU標記很適合免疫組化 IHC、免疫細胞化學IC、細胞內(nèi)ELISA、流式細胞分析和高通量篩選。

代謝活性檢測

檢測細胞群體的代謝活性也可以反映細胞增殖的情況。在細胞增殖過程中乳酸脫氫酶的活性會增加，因此四唑鹽或者Alamar Blue在代謝活躍的細胞環(huán)境中會逐漸減少，形成能夠改變培養(yǎng)基顏色的甲臜染料。您可以通過低配置或高配置的分光光度計和酶標儀來讀取含染料培養(yǎng)基的吸光度，從而衡量細胞的代謝活性，檢測細胞增殖的情況。

四種*-常見的四唑鹽是：MTT、XTT、MTS和WST1。MTT在標準的細胞培養(yǎng) 基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶體需要溶解在DMSO或者異丙醇中。因此，MTT主要作為終點檢測方法。其他三種鹽與Alamar Blue一樣，都是可溶且無毒的。它們可以作為連續(xù)監(jiān)控手段來跟蹤細胞增殖的動態(tài)改變。其中XTT的效率較低，需要添加額外的因子。而WST1更靈敏有效，與其他鹽相比能夠更快顯色。Alamar Blue的靈敏度也很高，只要微孔板的孔中有100個細胞它就能夠檢測到。四唑鹽和Alamar Blue氧化還原染料能夠用于多種儀器和高通量研究，非常方便。它們適用的檢測儀器包括：標準分光光度計、熒光分光光度計和酶標儀等。

增殖標志檢測

有些抗原只存在于增殖細胞中，而非增值細胞缺乏這些抗原，您也可以通過特異性的單抗來對細胞增殖進行檢測。例如，在人體細胞中，Ki-67抗體識別同名蛋白，在細胞周期S期、G2期和M期表達，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表達。用針對Ki-67蛋白的單抗就可以檢測細胞的增值情況。由于需要組織切片，這種方法無法進行高通量分析。不過這一方法頗受癌癥研究者們的青睞，因為它能夠用來檢測體內(nèi)腫瘤細胞的增殖。其他普遍使用的細胞增殖或細胞周期調(diào)控標志還包括，增殖細胞核抗原PCNA、拓撲異構酶IIB和磷酸化組蛋白H3。

ATP檢測

細胞內(nèi)的ATP含量受到了嚴格調(diào)控，檢測ATP也可以得到細胞增殖的信息。死亡細胞或即將死亡的細胞幾乎不含ATP，在細胞溶解物或提取物中測得的ATP濃度與細胞數(shù)之間存在嚴格的線性關系。利用熒光素酶luciferase及其底物熒光素luciferin的ATP檢測以生物發(fā)光為基礎，能夠為您提供非常靈敏的結果。如果有ATP存在熒光素酶就會發(fā)光，而且其發(fā)光強度與ATP濃度成正比，用能讀取發(fā)光信號的光度計和酶標儀都可以方便的進行檢測。這種方法非常適用于高通量細胞增殖檢測和篩選。

適合才是*-好的

怎樣選擇*-適合自己的檢測方法，這依賴于您的細胞類型和研究方案，當然還取決于您在細胞增殖中期望得到的信息。舉例來講，假如您已經(jīng)有了待測細胞(不論是在培養(yǎng)板還是在溶液中)，希望了解細胞增殖中的代謝活性變化，那您可以使用四唑鹽和比色法檢測。相應的，如果您對DNA合成的改變更感興趣，可以選擇用BrdU標記，再通過比色法、化學發(fā)光或熒光檢測進行分析。若您研究的是單個細胞，也可以用BrdU標記來檢測DNA合成，將其與熒光標記的相應抗體結合，您就可以通過流式細胞儀來進行流式分選。本文介紹的四種方案都是久經(jīng)考驗的可靠方法，選擇*-適合自己的檢測方式，好結果自然水到渠成。