實驗概要
本文介紹了電泳后主要的凝膠染色方法，包括：標(biāo)準(zhǔn)考馬斯亮藍(lán)染色法、快速考馬斯亮藍(lán)染色法、凝膠銨銀染色法、凝膠中性銀染色法及凝膠銅染色法。
實驗步驟
1. 標(biāo)準(zhǔn)考馬斯亮藍(lán)染色法
1) 電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)入一潔凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250(溶解于50%甲醇和10%乙酸中)；
2) 室溫下振搖溫育4h至過夜；
3) 去除染色液，收集保存可重復(fù)使用20-40次；
4) 依次在25%甲醇和7.5%乙酸中室溫振搖下脫色。靈敏度為0.1-0.5ug
蛋白／每條帶。
注：使用加熱的染色液或脫色液可以縮短染色或脫色時間。將染色液或脫色液在微波爐或水浴中加熱，(大約50-60℃)，染色時間可縮短至20min,脫色時間約 1-2h。
2. 快速考馬斯亮藍(lán)染色法
1) 電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)入一潔凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250(溶解于50%三lv乙酸中)；
2) 室溫下振搖溫育20min；
3) 去除染色液，收集保存可重復(fù)使用多次；
4) 加入數(shù)倍體積的脫色液(25%甲醇、7%乙酸)室溫振搖下脫色。必要時可更換脫色液。靈敏度為1.0ug蛋白／每條帶。
3. 凝膠銨銀染色法
1) 電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)入一潔凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的50%乙醇和10%乙酸，振搖30min至過夜；
2) 去除50%乙醇和10%乙酸，用去離子水清洗凝膠。加入20%乙醇, 室溫振搖30min；
3) 去除20%乙醇，再加5倍體積的20%乙醇，室溫振搖30min；
4) 去除20%乙醇，將凝膠轉(zhuǎn)入通風(fēng)柜內(nèi)，加入5倍體積的用去離子水配制的5％戊二醛，室溫振搖30min；
5) 去除戊二醛，用去離子水清洗凝膠。加入5倍體積的20%乙醇，室溫振搖20min；
6) 去除20%乙醇，重復(fù)6兩次；
7) 去除20%乙醇，用去離子水清洗凝膠。再加入5倍體積的用去離子水，室溫溫育１0min；
8) 去除去離子水，加入4倍體積新鮮配制的氨水／銀溶液，室溫振搖30min。配制100ml：加1.4ml 14.8mol/L氫氧化銨到100ml水中，再加入190ul 10mol/L氫氧化鈉；放置渦旋器上緩緩加入１ml新鮮配制的硝酸銀溶液(0.8g硝酸銀／ml水)，直至出現(xiàn)沉淀物，但很快溶解。
9) 去除氨水／銀溶液，用去離子水清洗凝膠20min以上，其間更換水?dāng)?shù)次；
10) 去除水，加入5倍體積新鮮配制的0.005%檸檬酸，0.019%的甲醛。輕柔混勻，數(shù)分鐘內(nèi)條帶即顯現(xiàn)出。當(dāng)背景開始變化時，去除顯影劑，用用去離子水清洗凝膠。在10%乙酸和20%乙醇中溫育凝膠，以終止反應(yīng)。靈敏度為1－10ng蛋白／每條帶。
注：操作時，應(yīng)戴手套并使用潔凈的玻璃器皿，以免污染，影響反應(yīng)的靈敏度。
4. 凝膠中性銀染色法
1) 電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)入一潔凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的30%乙醇和10%乙酸，振搖30min至過夜；
2) 去除乙醇/乙酸溶液，加入5倍體積的30%乙醇, 室溫振搖30min；
3) 去除乙醇，再加5倍體積的30%乙醇，室溫振搖30min；
4) 去除乙醇，加入10倍體積的去離子水，室溫振搖10min；重復(fù)用去離子水清洗兩次；
5) 去除去離子水，加入4倍體積新鮮配制的0.1%硝酸銀溶液(用室溫下貯存于棕色瓶內(nèi)的20%原液稀釋而得)，室溫振搖30min；
6) 去除硝酸銀溶液，用去離子水清洗凝膠20s；
7) 去除水，加入5倍體積的2.5%碳酸鈉和 0.02%的甲醛(pH<4.0),室溫振搖溫育，數(shù)分鐘內(nèi)條帶即顯現(xiàn)出。當(dāng)背景開始變黑時，停止溫育；
8) 在1％乙酸內(nèi)清洗，停止反映。用去離子水清洗，更換數(shù)次，每次10min; 靈敏度為1－10ng蛋白／每條帶。
5. 凝膠銅染色法
凝膠銅染色法為考馬斯亮藍(lán)或銀染色法的替代染色方法。將凝膠氯化銅溶液中溫育，在Tris和SDS同時存在時可形成明顯的白色不透明的沉淀物。蛋白條仍然清晰，留下一個多肽分離模式的附染圖象。由于蛋白質(zhì)未結(jié)合在凝膠上，可通過EDTA去除Cu離子而得以洗脫，因而該方法特別適合需快速定位蛋白條帶用于免疫反應(yīng)，或進一步進行蛋白質(zhì)化學(xué)研究。其染色模式如同考馬斯亮藍(lán)或銀染色法的凝膠，易進行拍照。
1) 電泳后，凝膠用蒸餾水短時清洗數(shù)次，每次30s,勿洗過長時間；
2) 將凝膠轉(zhuǎn)入一潔凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的0.3mol/L CuCl2；
3) 室溫振搖5min，較厚的凝膠可適當(dāng)延長時間。當(dāng)CuCl2進入凝膠時，在不含蛋白的區(qū)域會出現(xiàn)白色沉淀；
4) 用蒸餾水清洗數(shù)分鐘，在黑色背景下觀察結(jié)果。靈敏度為10-100ng蛋白／每條帶(0.5mm厚的凝膠)或１ug蛋白／每條帶(１mm厚的凝膠)。
注：將凝膠在0.25mol/L EDTA、0.25mol/L Tris溶液中溫育可使銅染逆轉(zhuǎn)。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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