質(zhì)粒提取主要有堿裂解法，煮沸裂解法，小量一步提取法等。
1、堿裂解法原理：根據(jù)共價閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓撲學
結(jié)構(gòu)差異來分離的。在強堿環(huán)境下，細菌的細胞壁和細胞膜被破壞，基因組DNA和質(zhì)粒DNA被釋放出來，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞而發(fā)生變性。雖然在強堿的條件下共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會發(fā)生變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結(jié)合在一起。當加入pH4.8的乙醋酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復性快，而線性的染色體DNA復性緩慢，細菌蛋白質(zhì)、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用鉀離子取代鈉離子時，復合物會從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復性的質(zhì)粒DNA。
2、煮沸法裂解：將細菌懸浮于含Triton X-100
和能消化細胞壁的溶菌酶緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細胞壁外，還有助于解開DNA鏈的堿基配對，并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。但是，閉環(huán)質(zhì)粒DNA彼此不會分離，這是因為他們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓撲結(jié)構(gòu)，當溫度下降后，閉環(huán)DNA的堿基又各自就位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體核蛋白質(zhì)，就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。
煮沸裂解法
對于小于15kb的小質(zhì)粒很有效，可用于提取步至lmL（小量制備），多至250mL（大量制備）菌液的質(zhì)粒，并且對大多數(shù)的大腸桿菌菌株都適用。
3、小量一步提取法：由于細菌染色體DNA
比質(zhì)粒大得多,受機械力后細菌染色體DNA會被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細胞碎片上，并發(fā)生變性。同樣受機械力質(zhì)粒DNA會變性，機械力消失后復性。但質(zhì)粒DNA的復性快，仍溶于溶液而細菌染色體DNA復性較慢，會形成不溶的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過高速離心可以分離得到質(zhì)粒DNA 。
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
客服一
