一、目的要求
1、學(xué)習(xí)分離、純化噬菌體的基本原理和方法。
2、學(xué)習(xí)噬菌體效價測定的基本方法。
二、基本原理
因為噬菌體是性寄生物，所以自然界中凡有細(xì)菌分布的地方，均可發(fā)現(xiàn)奇特異的噬菌體的存在，亦即噬菌體是伴隨著宿主細(xì)菌的分布而分布的，例如糞便與陰溝污水中含有大量大腸桿菌，故也能很容易的分離到大腸桿菌噬菌體；乳牛場有較多的乳酸桿菌，也容易分離到乳酸桿菌噬菌體等。由于噬菌體侵入細(xì)菌細(xì)胞后進(jìn)行復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)胞裂解，噬菌體即從中釋放出來，所以，（a）在液體培養(yǎng)基內(nèi)可使混濁菌懸液變?yōu)槌吻澹爽F(xiàn)象可指示有噬菌體存在；也可利用這一特性，在樣品中加入敏感菌株與液體培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)，使噬菌體增殖、釋放，從而可分離到特異的噬菌體；（b）在宿主細(xì)菌生長的固體瓊脂 平板上，噬菌體可裂解細(xì)菌而形成透明的空斑，稱噬菌體斑（圖1），一個噬菌體產(chǎn)生一個噬菌斑，利用這一現(xiàn)象可將分離到的噬菌體進(jìn)行純化與測定噬菌體的效價。
本實驗是從陰溝污水中分離大腸桿菌 噬菌體，剛分離出的噬菌體常不純，如表現(xiàn)噬菌斑的形態(tài)、大小不一致等，然后再進(jìn)一步純化。
噬菌體的效價就是1 毫升培養(yǎng)液中所含活噬菌體的數(shù)量。效價測定的方法，一般應(yīng)用雙層瓊脂平板法。由于含有特異宿主細(xì)菌 的瓊脂平板上，一個噬菌體產(chǎn)生一個噬菌體斑，因此，能進(jìn)行噬菌體的計數(shù)。
二、器材
37℃培養(yǎng)18 小時的大腸桿菌斜面，陰溝污水；
本實驗均用普通肉膏
蛋白胨培養(yǎng)基500 毫升三角瓶內(nèi)裝三倍濃縮的液體培養(yǎng)基100 毫升，試管液體培養(yǎng)基，瓊脂平板，上層瓊脂培養(yǎng)基（含瓊脂0.7%，試管分裝，沒管4 毫升），底層瓊脂平板（含培養(yǎng)基10 毫升，瓊脂2%）大腸桿菌 18 小時培養(yǎng)液，大腸桿菌噬菌體 10-2 稀釋液（用肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基稀釋）含 0.9 毫升液體培養(yǎng)基的小試管 4 支，肉膏蛋白胨瓊脂平板（ 10 毫升培養(yǎng)基， 2 ％瓊脂，作底層平板用），含 4 毫升瓊脂培養(yǎng)基的試管（ 0.7％瓊脂，作上層培養(yǎng)基用）5 管，滅菌小試管 5 支，滅菌 1 毫升吸管10 支，48 ℃ 水浴箱等。滅菌吸管，滅菌玻璃途布器，滅菌蔡氏細(xì)菌濾器，滅菌抽濾器，恒溫水浴箱，真空泵等。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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