1.生物大分子的純化
凝膠過(guò)濾是依據(jù)分子量的不同來(lái)進(jìn)行分離的，由于它的這一分離特性，以及它具有簡(jiǎn)單、方便、不改變樣品生物學(xué)活性等優(yōu)點(diǎn)，使得凝膠過(guò)濾成為分離純化生物大分子的一種重要手段，尤其是對(duì)于一些大小不同，但理化性質(zhì)相似的分子，用其它方法較難分開(kāi)，而凝膠過(guò)濾無(wú)疑是一種合適的方法。例如對(duì)于不同聚合程度的多聚體的分離等。
2.分子量測(cè)定
外水體積是指凝膠柱中凝膠顆粒周?chē)臻g的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動(dòng)相的體積。內(nèi)水體積是指凝膠顆粒中孔穴的體積，凝膠層析中固定相體積就是指內(nèi)水體積�；|(zhì)體積是指凝膠顆粒實(shí)際骨架體積。而柱床體積就是指凝膠柱所能容納的總體積。洗脫體積是指將樣品中某一組分洗脫下來(lái)所需洗脫液的體積。設(shè)柱床體積為Vt，外水體積為Vo，內(nèi)水體積為Vi，基質(zhì)體積為Vg，則有：
Vt＝Vo＋Vi＋Vg
由于Vg相對(duì)很小，可以忽略不計(jì)，則有：
Vt＝Vo＋Vi
設(shè)洗脫體積為Ve，Ve一般是介于Vo 和Vt之間的。對(duì)于完-全排阻的大分子，由于其不進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而只存在于流動(dòng)相中，故其洗脫體積Ve＝Vo；對(duì)于完-全滲透的小分子，由于它可以存在于凝膠柱整個(gè)體積內(nèi)（忽略凝膠本身體積Vg），故其洗脫體積Ve＝Vt。分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。
在一定的范圍內(nèi)，各個(gè)組分的Kav以及Ve與其分子量的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。
Kav＝－b lg MW＋c
Ve＝－b’ lg MW＋c’
由此通過(guò)對(duì)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行洗脫，作出Ve或Kav對(duì)分子量對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在相同的條件下測(cè)定未知物的Ve或Kav，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出其分子量。凝膠過(guò)濾測(cè)定分子量操作比較簡(jiǎn)單，所需樣品量也較少，是一種初步測(cè)定
蛋白分子量的有效方法。這種方法的缺點(diǎn)是測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性受很多因素影響。由于這種方法假定標(biāo)準(zhǔn)物和樣品與凝膠都沒(méi)有吸附作用，所以如果標(biāo)準(zhǔn)物或樣品與凝膠有一定的吸附作用，那么測(cè)量的誤差就會(huì)比較大；上面公式成立的條件是蛋白基本是球形的，對(duì)于一些纖維蛋白等細(xì)長(zhǎng)的形狀的蛋白不成立，所以凝膠過(guò)濾不能用于測(cè)定這類(lèi)分子的分子量；另外由于糖的水合作用較強(qiáng)，所以用凝膠過(guò)濾測(cè)定糖蛋白時(shí)，測(cè)定的分子量偏大，而測(cè)定鐵蛋白時(shí)則發(fā)現(xiàn)測(cè)定值偏�。贿�要注意的是標(biāo)準(zhǔn)蛋白和所測(cè)定的蛋白都要在凝膠過(guò)濾的線性范圍之內(nèi)。
3.脫鹽及去除小分子雜質(zhì)
利用凝膠過(guò)濾進(jìn)行脫鹽及去除小分子雜質(zhì)是一種簡(jiǎn)便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脫鹽要快得多，而且一般不會(huì)造成樣品較大的稀釋，生物分子不易變性。一般常用的是Sephadex G-25，另外還有Bio-Gel P-6 DG或Ultragel AcA 202等排阻限較小的凝膠類(lèi)型。目已有多種脫鹽柱成品出售，使用方便，但價(jià)格較貴。
4.去熱源物質(zhì)
熱源物質(zhì)是指微生物產(chǎn)生的某些多糖蛋白復(fù)合物等使人體發(fā)熱的物質(zhì)。它們是一類(lèi)分子量很大的物質(zhì)，所以可以利用凝膠過(guò)濾的排阻效應(yīng)將這些大分子熱源物質(zhì)與其它相對(duì)分子量較小的物質(zhì)分開(kāi)。例如對(duì)于去除水、氨基酸、一些注射液中的熱源物質(zhì)，凝膠過(guò)濾是一種簡(jiǎn)單而有效的方法。
5.溶液的濃縮
利用凝膠顆粒的吸水性可以對(duì)大分子樣品溶液進(jìn)行濃縮。例如將干燥的Sephadex（粗顆粒）加入溶液中，Sephadex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物質(zhì)也會(huì)滲透進(jìn)入凝膠孔穴內(nèi)部，而大分子物質(zhì)則被排阻在外。通過(guò)離心或過(guò)濾去除凝膠顆粒，即可得到濃縮的樣品溶液。這種濃縮方法基本不改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度和pH值。
6.蛋白質(zhì)的復(fù)性
為了減少高濃度下的聚集反應(yīng),凝膠過(guò)濾層析技術(shù)也可以用來(lái)進(jìn)行蛋白的體外復(fù)性。層析介質(zhì)的隔離作用,降低了蛋白之間相互作用產(chǎn)生的聚集,使復(fù)性濃度、復(fù)性率都得到很大的提高。同時(shí),蛋白經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾層析本身也可得到一定的純化。
兩個(gè)重要的因素影響凝膠過(guò)濾層析復(fù)性蛋白質(zhì)的收率：第1個(gè)是變性條件下蛋白質(zhì)的上樣，第二個(gè)是復(fù)性緩沖液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。另外，蛋白質(zhì)上樣量也會(huì)影響蛋白質(zhì)復(fù)性收率，因?yàn)樵趯游鲋捻敹藭?huì)因?yàn)樯蠘恿康脑黾佣l(fā)生結(jié)構(gòu)的聚集。
為了提高蛋白質(zhì)復(fù)性效率，發(fā)展了一種梯度凝膠過(guò)濾層析復(fù)性方法。在色譜柱中預(yù)先設(shè)置變性劑濃度的梯度，當(dāng)復(fù)性的蛋白質(zhì)進(jìn)入到柱子中后，由于蛋白質(zhì)的表觀分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于變性劑的，從而蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)了一個(gè)變性劑濃度逐步降低的環(huán)境，蛋白質(zhì)逐步地折疊復(fù)性，從而有效地降低了聚集體的形成，并能把聚集體和折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。
線性梯度在凝膠過(guò)濾層析中可能經(jīng)常會(huì)遇到，但是有時(shí)有些蛋白質(zhì)可能在某些變性劑濃度下不穩(wěn)定，在梯度過(guò)程中需要盡快跨越這些濃度過(guò)程；有時(shí)蛋白質(zhì)折疊的限速在某些變性劑濃度，此時(shí)需要增加此段的時(shí)間，所以在凝膠過(guò)濾層析中可以設(shè)計(jì)不同類(lèi)型的梯度形式，以滿足不同的蛋白質(zhì)的復(fù)性需要。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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