實(shí)驗(yàn)室為了進(jìn)行檢驗(yàn)質(zhì)量控制、檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證、確認(rèn)滅菌效果、培養(yǎng)基或其他生物試劑性能確認(rèn)等方面的工作，都需要用到一定量的標(biāo)準(zhǔn)菌株。按照中國(guó)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家認(rèn)-可委員會(huì)指-定的檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)-可準(zhǔn)則(CNAL/AC01)中關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的規(guī)定，微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)嚴(yán)格其保存、使用、管理及確認(rèn)程序。微生物標(biāo)準(zhǔn)菌株的保存、使用和管理是微生物實(shí)驗(yàn)室的一項(xiàng)重要工作。
獲取
實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株可以通過(guò)購(gòu)買(mǎi)、交換、接受贈(zèng)送等途徑獲得。實(shí)驗(yàn)室自行分離的菌株對(duì)圖標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)過(guò)鑒定后，可以做為參考菌株(參考培養(yǎng)物， reference cultures)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用。
標(biāo)準(zhǔn)菌株的源頭是門(mén)的菌種保藏機(jī)構(gòu)的菌株，如ATCC (American Type Culture Collection美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)的菌株、其他國(guó)外權(quán)威菌種保藏機(jī)構(gòu)或我國(guó)國(guó)家菌種庫(kù)儲(chǔ)存的各標(biāo)準(zhǔn)菌株等。
需要注意，商業(yè)來(lái)源的菌株是演化菌株(派生菌株),并不是原代菌株，例如：商業(yè)ATCC菌株都是派生菌株。保藏中心提供的菌都有固定的編號(hào)（菌株號(hào))。
通常菌株編號(hào)由兩部分組成：面是幾個(gè)字母的縮寫(xiě)代表菌種保藏機(jī)構(gòu)，后面緊跟一串?dāng)?shù)字表明其編號(hào)。
活化
從菌種保藏中心購(gòu)買(mǎi)的菌種一般是安瓿瓶裝的凍干粉劑，近來(lái)又出現(xiàn)了幾種新的菌種保藏方式，如： MAST CRYOBANK菌種保藏管、LyfoCults Plus菌種保藏系統(tǒng)、Culti -Loops菌種保藏系統(tǒng)等。
參照隨附的菌種使用活化方法進(jìn)行活化。商品化的保藏菌株須按照廠商的說(shuō)明進(jìn)行，對(duì)于有特殊條件要求的菌株尤其要按照推薦的方法執(zhí)行。
根據(jù)GB 19489 《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求規(guī)定》，病原微生物分為I~N危害等。實(shí)驗(yàn)室在符合相應(yīng)生物安全水平的條件下，進(jìn)行菌種活化，一定要做好防護(hù)。食品微生物實(shí)驗(yàn)室一般只需儲(chǔ)存危害等I、II的微生物，高危害等的微生物不應(yīng)在食品微生物實(shí)驗(yàn)室保存。
(一)外包裝的開(kāi)啟
從保藏中心購(gòu)買(mǎi)的菌株通常有三層包裝。內(nèi)層(如安瓿瓶)是用于盛放微生物，完-全密閉，外面用吸水材料包裹，泄漏時(shí)起吸附作用。中間層是用塑料罐、泡沫塑料等制成的，對(duì)內(nèi)層起支撐保護(hù)作用，該層可以裝數(shù)個(gè)內(nèi)層容器，兩者之間有填充填料。外層是硬紙板箱、木箱、塑料箱等制成的，用于保護(hù)內(nèi)包裝。
包裝開(kāi)啟先要根據(jù)菌種所需的防護(hù)水平，穿防護(hù)服，帶好手套、kou罩、帽子，然后檢查菌種包裝外觀，仔細(xì)看有無(wú)滲漏、破損等異�，F(xiàn)象。檢查無(wú)異常后將外包裝除去，依次檢查中間層、內(nèi)層，直至完-全打開(kāi)。
若發(fā)現(xiàn)內(nèi)外層包裝都有破損滲漏現(xiàn)象，并且安瓿瓶等微生物容器已經(jīng)破損，要立刻通知有關(guān)部門(mén)和菌種發(fā)放單位，對(duì)包裝、運(yùn)輸工具等微生物污染物進(jìn)行消毒。若外包裝有破損等異常情況，但安瓿瓶等微生物容器無(wú)破損，或安瓿瓶等微生物容器已破損，但外包裝無(wú)破損、滲漏情況，則無(wú)需溯源。對(duì)安瓿瓶等微生物容器無(wú)破損，按要求開(kāi)啟；對(duì)安瓿瓶等微生物容器已破損，可按照生物安全操作原則，對(duì)微生物污染物進(jìn)行消毒滅菌處理。
(二)安瓶瓶的開(kāi)啟及菌種復(fù)活
檢查完好無(wú)損的安瓶瓶可以開(kāi)啟，一般按下面方法打開(kāi)內(nèi)層包裝，取菌種。
單瓶安瓶瓶，先用75%酒精棉擦拭安瓶瓶上部，再用砂輪在安瓿瓶上部橫向銼一道痕跡，然后將劃痕處向外，用無(wú)菌脫脂棉包住安瓿瓶(保護(hù)雙手),手持安瓿瓶從銼痕處稍向外用力打開(kāi)安瓶瓶。還可采用將安瓿管頂部燒熱，滴上幾滴無(wú)菌冷水或用無(wú)菌棉簽沾冷水在頂部擦一擦，頂部出現(xiàn)裂紋，用消毒鑷子輕叩一下，敲下安瓿管的頂端。
雙瓶安剖瓶先把外瓶的頂端燒熱，再在頂端滴幾滴冷水，使頂端玻璃出現(xiàn)裂紋，用鑷子等敲掉頂端，-后用消毒鑷子取出絕緣層和閃瓶。
選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件(根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明)進(jìn)行復(fù)活。凍干菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò)5代，從菌種保藏中心購(gòu)買(mǎi)的凍干菌種為第0代。
細(xì)菌的復(fù)活方法：用無(wú)菌吸管(或移液器)吸0.5 mL液體培養(yǎng)基加到凍干菌塊上，吹打制成菌懸液。將全部菌懸液移入5ml合適的肉湯培養(yǎng)基中。將管中殘留的幾滴懸液移種到斜面上。在合適的條件下培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)溫度通常為25℃或37℃。多數(shù)凍干菌株會(huì)在幾天后長(zhǎng)出，但是少數(shù)菌會(huì)表現(xiàn)出延滯期延長(zhǎng)的現(xiàn)象，需要將正常培養(yǎng)時(shí)間加倍。
霉菌和酵母菌的復(fù)活方法：用無(wú)菌吸管(或移液器)吸0.5 ml-1 ml無(wú)菌水到凍干菌塊上，將全部?jī)?nèi)容物移入裝有5mL無(wú)菌水的試管中進(jìn)行復(fù)水，2h (或過(guò)夜)后接種到肉湯或固體瓊脂上，在合適的溫度下培養(yǎng)，真菌培養(yǎng)溫度通常是25℃。少數(shù)培養(yǎng)物會(huì)表現(xiàn)出延滯期延長(zhǎng)的現(xiàn)象，需要將正常培養(yǎng)時(shí)間加倍。如菌株在推薦的條件下培養(yǎng)不生長(zhǎng)，須滅菌處理之后方可丟棄。
(三) MAST CRYOBANK菌種保藏管的使用
MAST CRYOBANK菌種保藏管是由冰凍小管組成的多功能保藏系統(tǒng)，每支小管中包含20-25粒覆有特殊低溫防腐溶液且經(jīng)過(guò)化學(xué)處理的珠子。菌種保藏時(shí)，只需將經(jīng)純化培養(yǎng)培養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛的菌株接入保藏管溶液中，通常需要4~7環(huán)，苛養(yǎng)菌要多接一些，擰緊蓋子充分震蕩，細(xì)菌即吸附在小珠子上，再用無(wú)菌吸管吸走溶液，放入冰箱保藏， -70℃可保存10年，-15 ℃~-10℃可保存1年~3年。
菌種的活化只需將小珠放在合適的瓊脂平板上滾動(dòng)或置于肉湯中培養(yǎng)即可。
(四) LyfoCcults Plus菌種保藏系統(tǒng)
LyfoCcults Plus菌種保藏系統(tǒng)是一個(gè)集儲(chǔ)存、復(fù)溶和接種于一體的系統(tǒng)。形狀像鋼筆，使用方便。使用時(shí)只需撕開(kāi)鋁箔袋，取出LyfoCults Plus裝置，旋開(kāi)一端，取出接種棒，用力擠捏另一端的塑料安剖瓶的液體，混勻后流入帶干粉狀菌小管中，用接種棒在小管中攪動(dòng)，使菌復(fù)溶形成菌懸液，用接種棒蘸兩滴菌液接種到培養(yǎng)基上，涂抹均勻后進(jìn)行培養(yǎng)復(fù)蘇。
菌種保藏系統(tǒng)的使用見(jiàn)。
(1)從箔片包裝上揭下預(yù)先打印好的標(biāo)簽，貼在要接種的培養(yǎng)基上。
(3)撕開(kāi)安全密封條。
(4)旋開(kāi)小管上的敷抹器，打開(kāi)系統(tǒng)。
(5)用力擠壓安瓿瓶，使所有的液體化合物倒進(jìn)小管中。
(6)混勻。
(7)把小管的頂部作為移液管，在培養(yǎng)基上滴兩滴菌懸液。
(8)用小管的尖端在培養(yǎng)基上劃線。
(五) Culti-Loops菌種保藏系統(tǒng)
Culti-Loops菌種保藏系統(tǒng)是一種接種環(huán)形式的菌種保藏系統(tǒng)，接種環(huán)上有少量的菌，無(wú)需制備，可直接在平板上劃線進(jìn)行活化，每個(gè)接種環(huán)可接5塊平板。此保藏系統(tǒng)除彎曲菌需冷凍保存（-18℃）外，其他只需2℃~8℃保存。
(六)實(shí)驗(yàn)室其他方法保藏菌株的復(fù)活
實(shí)驗(yàn)室內(nèi)采用其他方法保藏的菌種復(fù)活時(shí)可按不同的方法。如在超低溫冰箱中的菌種，復(fù)活時(shí)，只需取出冷凍菌種的小管，在室溫下融化后接種在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)即可。液體石蠟法、沙土管保藏法、半固體穿刺保藏法保藏的，用接種環(huán)挑取即可。
確認(rèn)
菌種確認(rèn)-可從菌落形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)，芽孢大小、位置、形狀，生化鑒定等方面進(jìn)行。
(一)菌落形態(tài)
取復(fù)活后的菌，在相應(yīng)的鑒別平板或普通非選擇性平板上劃線分離，培養(yǎng)出單菌落，觀察菌落形態(tài)是否符合，同一平板上的單菌落的大小、形狀、顏色、質(zhì)地、光澤等是否相似；對(duì)于出現(xiàn)兩種或以上形態(tài)的菌株，應(yīng)再分別挑取單菌落劃線或稀釋涂布培養(yǎng)，檢測(cè)是否重復(fù)出現(xiàn)相同特征。
(二)細(xì)胞形態(tài)
對(duì)數(shù)生長(zhǎng)-期的培養(yǎng)物革蘭氏等染色反應(yīng)應(yīng)呈現(xiàn)一致性，細(xì)胞形狀、大小、鞭毛、莢膜等特征應(yīng)相似。
(三)芽孢
形成芽孢的菌種，其芽孢大小、位置、形狀應(yīng)相似。
(四)生化鑒定
必要時(shí)進(jìn)行生化鑒定等實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確認(rèn)。
在菌種確認(rèn)過(guò)程中，如發(fā)現(xiàn)菌種有污染，則要分離挑選目標(biāo)菌株，培養(yǎng)成功后將污染培養(yǎng)物高壓滅菌處理。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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