PCR產(chǎn)物的直接純化：
一、原理
PCR產(chǎn)物一般都含有過量的引物、 Taq DNA酶及dNTP，這些成分的存在將直接影響到后續(xù)的酶切、雙脫氧PCR測(cè)序反應(yīng)等過程,因此有必要除去。目核酸純化的方法有很多,商用化試劑盒的出現(xiàn)使得DNA的純化過程變得更加簡(jiǎn)便快捷。本實(shí)驗(yàn)中, Buffer PCR-A促使大于100bp的DNA－－pian斷選擇性地吸附到 silica膜上。經(jīng) Buffer W. BufferW2洗滌去除殘留在sica膜上的小于50-mer的引物、酶
蛋白、單核苷酸、熒光染料或放射性同位素標(biāo)記的單核苷酸后,吸附到sica膜上的DNA－－pian斷經(jīng)微量水或 Eluent洗脫下來,即可用于各種分子生物學(xué)的操作。
二、材料與方法
1、材料PCR產(chǎn)物
2、儀器、用具
恒溫孵育器(65C)、離心機(jī)、移液器、1.5ml離心管
3、試劑
Buffer_PCR -A Buffer w1；已加無水乙醇的 Buffer V2 Eluent或去離子水
4、方法
(1)在PCR反應(yīng)液中加入3倍體積的 Buffer PCR-A若需加入的 BufferPCR-A不足100ul,則加入100ul。
(2)將DNA －－prep Tube置于2 -ml Microfuge Tube中,將步驟(1)中的混合液移入DNA -prep Tube I中,5500rpm離心1min。
(3)棄濾液,將DNA -prep Tube置回到原2 -ml Microfuge Tube中,加入500 ul Bufer W1,5500rpm離心1min。
(4)棄濾液,將DNA -prep Tube置回到原2 -ml Microfuge Tube中,加入700山已加無水乙醇的 Buffer V2,5500rpm離心1min,以同樣的方法再用700山己加無水乙醇的 Buffer\2洗滌一次。
(5)棄濾液,將DNA -prep Tube置回到原2 -mi Microfuge Tube中1400opm離心1min
(6)連濾液一并棄掉收集管,將DNA -prep Tube置于一新的1.5ml離心管中,在sia膜中央加入25-30 ll Eluente或去離子水(65℃預(yù)熱)
(7)室溫靜置2min,1400opm離心1min洗脫DNA。
(8)取5山樣品,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化結(jié)果
PCR產(chǎn)物切膠回收:
1、在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠,計(jì)算凝膠重量。(100mg凝膠,計(jì)100ul體積)(盡量縮短暴露UV燈下的時(shí)間）。
2、加入3個(gè)凝膠體積的 Buffer DE-A(600uD,混合均勻后,于65°C加熱,直至凝膠完-全熔化。
3、加0.5個(gè) Bufifer DE-A體積的 Buffer DE-B(300uD,混合均勻,當(dāng)分離的DNA－－pian段小于400bp時(shí),加入1個(gè)凝膠體積的異丙醇。
4、吸取3中的混合液,轉(zhuǎn)移到DNA制備管(置于2ml離心管中),12,000×g離心1min棄濾液。
5、將制備管置回2ml離心管中,加500 ul Buffer W,12,000×g離30sec棄濾液。
6、將制備管置回2ml離心管中,加700 ul Buffer W2,12000×g離心30sec棄濾液。重復(fù)一次。
7、將制備管置回2ml離心管中,12,000Xg離心1min徹-底去除殘余的液體。
8、將制備管置于1.5ml離心管中,在制備膜中央,加25~30ul65 Eluent或去離子水,室溫靜置1min。12,000×g離心1min洗脫DNA
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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