流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的一種單細(xì)胞定量分析和分選技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)是單克隆
抗體及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、激光和電子計(jì)算機(jī)科學(xué)等高度發(fā)展及綜合利用的高技術(shù)產(chǎn)物。
一、基本結(jié)構(gòu)
流式細(xì)胞儀由三部分構(gòu)成
1.液流系統(tǒng)，包括流動(dòng)室和液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng);
2.光學(xué)系統(tǒng)，包括激發(fā)光源和光束收集系統(tǒng);
3.電子系統(tǒng)，包括光電轉(zhuǎn)換器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。流式細(xì)胞儀的I作原理是使懸浮在液體中分散的經(jīng)熒光標(biāo)記的細(xì)胞或微粒逐個(gè)通過(guò)樣品池，同時(shí)由熒光探測(cè)器捕獲熒光信號(hào)并轉(zhuǎn)換成分別代表向散射角、側(cè)向散射角和不同熒光強(qiáng)度的電脈沖信號(hào)，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理形成相應(yīng)的點(diǎn)圖，直方圖和加三維結(jié)構(gòu)圖像進(jìn)行分析。用于FCM的樣本是單細(xì)胞懸液，可以是血液、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液、各種體液、新鮮實(shí)體瘤的單細(xì)胞懸液以及石蠟包埋組織的單細(xì)胞懸液等。
二、流式細(xì)胞術(shù)的基本操作與技巧
1）細(xì)胞的制備、培養(yǎng)
2）封閉
3）熒光素偶聯(lián)抗體標(biāo)記
4）光電倍增管電壓的設(shè)定
5）對(duì)照的設(shè)置
6）補(bǔ)償調(diào)節(jié)
以體外培養(yǎng)的PBMC細(xì)胞為例：
1、細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，直接收集細(xì)胞于1.5ml的EP管中，350g，4°C離心5min，棄上清；
2、然后用1ml FACS buffer重懸沉淀，350g，4°C離心5min，棄上清；
3、封閉：標(biāo)記樣品細(xì)胞的熒光素偶聯(lián)抗體多為單克隆抗體，少數(shù)也可能是多克隆抗體，其基本結(jié)構(gòu)都由兩部分組成，即包含有特異性結(jié)合抗原位點(diǎn)的Fab段和相對(duì)保守的Fc段，抗體的特異性表現(xiàn)在Fab段，標(biāo)記時(shí)利用Fab段的抗原結(jié)合位點(diǎn)與細(xì)胞上抗原分子特異性結(jié)合，從而標(biāo)記并且相對(duì)量化細(xì)胞表達(dá)該抗原分子的情況。但是，有些細(xì)胞表面表達(dá)FcR(Fc receptor, Fc受體），如巨噬細(xì)胞、DC、B淋巴細(xì)胞等， FcR可以與熒光素偶聯(lián)抗體的Fc段進(jìn)行非特異性的結(jié)合，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。
封閉方法1： 取適量的血清全I(xiàn)gG抗體與樣品細(xì)胞充分混勻，4＇C靜置 15min。研究人的細(xì)胞時(shí)，若熒光素偶聯(lián)抗體來(lái)源于小鼠，封閉采用小鼠血清全I(xiàn)gG抗體。原則是，如果流式抗體可能與樣品細(xì)胞的FcR發(fā)生非特異性結(jié)合，那么在標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體之先用流式抗體同源的全I(xiàn)gG抗體進(jìn)行封閉，使樣品細(xì)胞表面的FcR飽和。
封閉方法2： 適量的抗CD16和抗CD32單克隆抗體與樣品細(xì)胞充分混勻，4＇C靜置 15min。CD16是一種FcR, 能夠與IgG的Fc段結(jié)合，親和力較強(qiáng)；CD32也是一種 FcR, 能夠與IgG的Fc段結(jié)合，親和力中等。而熒光素偶聯(lián)抗體基本上是IgG抗體，所以在標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體可以用抗CD16和抗CD32單克隆抗體封閉樣品細(xì)胞，使樣品細(xì)胞表面的FcR都被抗CD16 或抗CD32單克隆抗體結(jié)合，從而阻止后續(xù)熒光素偶聯(lián)抗體與FcR的非特異性結(jié)合。
4、標(biāo)記相應(yīng)的熒光素偶聯(lián)抗體，這里以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC為例，一般染色體系推薦100μl，CD3、CD4表達(dá)量相對(duì)較高，1μl足夠了，假如有9個(gè)樣本，分別取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中，混勻后，分別取100μl加到9個(gè)樣品孔中，混勻，室溫、避光染色20min；
5、加1ml FACS buffer洗去未結(jié)合的抗體，350g，4°C離心5min，棄上清，用200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重懸沉淀，盡快上機(jī)分析。
6、電壓的設(shè)定：上機(jī)分析時(shí)，確認(rèn)機(jī)器沒(méi)有問(wèn)題后，先就是調(diào)節(jié)每個(gè)通道的光電倍增管的電壓，目的是為了區(qū)分細(xì)胞群，假如我們想研究人的淋巴細(xì)胞群，我們都知道人的PBMC含有淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞還有中性粒細(xì)胞等，那我們?cè)趺窗阉鼈兎珠_(kāi)呢？這時(shí)候就要用到我們面提過(guò)的FSC和SSC，通過(guò)調(diào)節(jié)FSC和SSC的電壓，區(qū)分淋巴細(xì)胞亞群，原則就是使樣品細(xì)胞或者目標(biāo)細(xì)胞位于流式圖的中央或者靠近中央的位置。FSC和SSC的電壓確定之后就開(kāi)始調(diào)節(jié)APC-cy7、FITC的電壓（我們可以在鋪細(xì)胞的時(shí)候多鋪一個(gè)孔，染色時(shí)將CD3-APC-cy7、CD4-FITC均染上，用于FSC、SSC、APC-cy7、FITC電壓的調(diào)節(jié)），原則就是使陽(yáng)性細(xì)胞群和陰性細(xì)胞群盡可能的分離。
三、注意事項(xiàng)
（1）在細(xì)胞制備、培養(yǎng)階段，如果該培養(yǎng)細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，需用先用胰酶消化細(xì)胞，然后收集待測(cè)樣品細(xì)胞，離心、洗滌、封閉后標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體即可。
（2）如果是胸腺、脾臟和淋巴結(jié)等外周免疫器官，主要由免疫細(xì)胞組成，制成單細(xì)胞懸液，只需直接將臟器經(jīng)鋼網(wǎng)研磨即可。
（3）如果是實(shí)體臟器肺臟、肝臟和腫瘤組織內(nèi)含有較多的結(jié)締組織，實(shí)體臟器細(xì)胞之間一般結(jié)合緊密，所以直接研磨臟器法無(wú)法得到理想的單細(xì)胞懸液。因此，研磨需將臟器剪碎后加入IV型膠原酶和DNA核酸內(nèi)切酶消化，消化后的組織再用研磨棒直接研磨。實(shí)體臟器研磨后的單細(xì)胞懸液以實(shí)體細(xì)胞為主，如果研究目標(biāo)不是實(shí)體細(xì)胞，而是臟器內(nèi)浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞，可以用Percoll密度梯度離心法富集免疫細(xì)胞，然后再進(jìn)行流式分析。
（4）調(diào)節(jié)電壓時(shí)，如果檢測(cè)的目標(biāo)細(xì)胞體積較小，可以適當(dāng)提高電壓值，使目標(biāo)細(xì)胞與細(xì)胞碎片在流式圖中能夠完-全分離；如果檢測(cè)的目標(biāo)細(xì)胞體積較大，可以適當(dāng)降低電壓值，使所有的目標(biāo)細(xì)胞群完整顯示于流式圖中，防止細(xì)胞群接近于流式圖的邊界而變形扭曲或者完-全處于邊界外。
（5）關(guān)于樣本的封閉，并不是標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體之必須封閉樣品，一般樣品細(xì)胞與流式抗體的種屬來(lái)源是不同的，如標(biāo)記人的細(xì)胞的熒光素偶聯(lián)抗體一般來(lái)源于小鼠，人細(xì)胞的FcR也不一定能夠與小鼠來(lái)源的熒光素偶聯(lián)抗體的Fc段結(jié)合，但是，也有可能因?yàn)榉N屬關(guān)系較近，或者在一定環(huán)境條件下這種不同種屬間的Fc段和FcR也能結(jié)合，實(shí)驗(yàn)者很難判斷實(shí)驗(yàn)過(guò)程中這種結(jié)合是否會(huì)發(fā)生，但是在標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體封閉樣品卻可以保-證這種非特異性結(jié)合一定不會(huì)發(fā)生。所以，條件允許的話，實(shí)驗(yàn)者-好養(yǎng)成封閉樣品的習(xí)慣。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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