（一）核糖核酸酶A核糖核酸酶A（RNase A）來源于牛胰臟，是一種內(nèi)切核糖核酸酶，可特異攻擊RNA上嘧啶殘基的3’端，切割胞嘧啶或尿嘧啶與相鄰核苷酸形成的磷酸二酯鍵，反應(yīng)終產(chǎn)物是3’嘧啶核苷酸和末端帶3’嘧啶核苷酸的寡核苷酸。無輔助因子及二價陽離子存在時，核糖核酸酶A的作用可以被胎盤RNA酶抑制劑（RNasin）或氧釩一核糖核苷復(fù)合物（vanadyl—ribonuclosidecomplex，VRC）所抑制。RNase A的反應(yīng)條件廣，且難失活。在低鹽濃度（0～100 mmol/l NaCl）下，RNase A切割單鏈和雙鏈RNA、DNA：RNA雜交體中的RNA；當(dāng)NaCl濃度為300 mmol/l�；蚋邥r，RNase A就特異性切割單鏈RNA。去除反應(yīng)液中的RNase A，通常需要蛋白酶K處理、酚反復(fù)抽提和乙醇沉淀。在分子克隆中，核糖核酸酶A的主要用途為：
①從DNA：RNA雜交體中去除未雜交的RNA區(qū)。
②確定RNA或DNA中的單堿基突變的位置。在RNA：DNA或RNA：RNA雜交體中，若存在單堿基錯配，可用RNAse A識別并切割。通過凝膠電泳分析切割產(chǎn)物的大小，即可確定錯配的位囂。
③RNA檢測。RNA酶保護(hù)分析法（RNase protection assay）是近年來發(fā)展起來的一種檢測RNA的雜交技術(shù)。其基本原理是利用單鏈RNA探針，與待測的RNA樣品進(jìn)行雜交形成RNA：RNA雙鏈分子，由于RNA酶可一性地降解未雜交的單鏈RNA，而雙鏈?zhǔn)艿奖Ｗo(hù)不被降解，經(jīng)凝膠電泳可以確定目的RNA的長度。該方法靈敏度較Northern雜交法更高，并可進(jìn)行較為準(zhǔn)確的定量。選擇適當(dāng)?shù)奶结�，還可進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分析及內(nèi)含子（也稱內(nèi)元）剪切位點(diǎn)分析等研究。此法的靈敏度比核酸酶S1保護(hù)分析法高數(shù)倍。
④降解DNA制備物中的RNA分子。須使用無DNAsd的RNase（DNase I free RNase），市售的一般RNase A常含有DNase，可在100 retool/I Tris—CI（pH 7．5）和15 mmol/l。NaCI溶液中100℃加熱15 min，以去除之。
（二）核糖核酸酶T1核糖核酸酶T1（RNase T1）來源于米曲霉（Aspergillus orjzae），它特異地作用于鳥嘌呤3’端磷酸，切割位點(diǎn)在鳥嘌呤的3’磷酸和相鄰核苷酸的5‘羥基之問的磷酸二酯鍵，反應(yīng)終產(chǎn)物為3’鳥苷酸和末端帶3’鳥苷酸的寡核苷酸片段。RNaseTl的反應(yīng)條件廣，且難失活，其催化活性類似于RNase A。
在RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，RNase T1與RNase A聯(lián)合使用，對RNA進(jìn)行定量和作圖；還可用于去除DNA：RNA雜交體中未雜交的RNA區(qū)。
（三）核糖核酸酶H核糖核酸酶H（RNase H）早是從小牛胸腺組織中發(fā)現(xiàn)的，其編碼基因已被克隆到大腸桿菌中。它能特異地降解DNA：RNA雜交雙鏈中的RNA鏈，產(chǎn)生具有3’一OH和5’一磷酸末端的寡核苷酸和單核苷酸，它不能降解單鏈或雙鏈的DNA或RNA。
在分子克隆中，核糖核酸酶H的主要用途是與大腸桿菌DNA聚合酶工和DNA連接酶一起參加cDNA克隆中第二條I）NA互補(bǔ)鏈的合成。當(dāng)用逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成cDNA第1鏈之后，用RNase H部分消化mRNA：DNA雜交分子中的RNA，產(chǎn)生的RNA－－-片段就像岡崎片段一樣，作為大腸桿菌DNA聚合酶T的引物，以cDNA第1鏈為模板合成DNA，直到把mRNA全部代替。然后在DNA連接酶的作用下，封閉缺口形成雙鏈cDNA。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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