當(dāng)純凈甲醛在水溶液中溶解時(shí)，會(huì)自動(dòng)聚合成長(zhǎng)鏈的多聚甲醛。其長(zhǎng)度不一，在水中同時(shí)進(jìn)行聚合與解聚反應(yīng)。甲醛易溶于脂類(lèi)物質(zhì)，因此能穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。用多聚甲醛固定細(xì)胞時(shí)，能使細(xì)胞內(nèi)的自由氨基基團(tuán)發(fā)生化學(xué)交聯(lián)。當(dāng)不同的分子發(fā)生交聯(lián)時(shí)，形成一網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，把細(xì)胞的各個(gè)結(jié)構(gòu)成分連接起來(lái)。
單獨(dú)用多聚甲醛固定細(xì)胞不能使抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原時(shí)，標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定后必須用非離子去污劑透化標(biāo)本。
不主張使用商業(yè)甲醛溶液作為細(xì)胞染色的固定液，因?yàn)樯虡I(yè)甲醛實(shí)際上是甲醛和甲醇（乙醇）的混合物，甲醇和乙醇的作用是防止甲醛分子聚合，使其保持單體狀態(tài)。使用商業(yè)甲醛處理細(xì)胞有兩個(gè)缺陷：不具有多聚甲醛固定細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)；細(xì)胞卻被甲醇固定。
多聚甲醛固定方法為：
①用PBS洗滌玻片或培養(yǎng)皿；如果是單個(gè)的載玻片或蓋玻片，用鑷子鑷取，放入裝有PBS的燒杯中。如果載玻片或蓋玻片的數(shù)量較多，將其放在用的支架上。如果是培養(yǎng)皿，將PBS倒入其中洗滌；
②倒掉PBS，但勿使標(biāo)本干燥；
③加入4%多聚甲醛(臨用配制)，室溫下靜置10min；
④用PBS洗滌細(xì)胞兩次；
⑤用含0.2%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的細(xì)胞2min（室溫），有些標(biāo)本可能需要長(zhǎng)達(dá)15min，時(shí)間視抗原而定；
⑥PBS洗滌細(xì)胞4次，洗滌時(shí)間不少于5min。此時(shí)，可加入抗體。
常見(jiàn)問(wèn)題 ：
用交聯(lián)劑如多聚甲醛固定蛋白質(zhì)比用有機(jī)溶劑能更好地保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但可能降低某些細(xì)胞組分的抗原性。經(jīng)多聚甲醛固定后，與胞內(nèi)自由氨基結(jié)合的抗體也許不再識(shí)別這些抗原。如果抗體在其他實(shí)驗(yàn)中效果良好，但在經(jīng)多聚甲醛固定的標(biāo)本中不能有效地作用，可以嘗試逐步降低多聚甲醛的濃度。這樣雖然使細(xì)胞內(nèi)各成分的交聯(lián)程度降低，但有利于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的保持，可以使抗體更好地與抗原中的某些結(jié)合部位接觸。
注意事項(xiàng)：
①多聚甲醛的固定是不穩(wěn)定的，標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定后應(yīng)再經(jīng)去污劑處理，如果標(biāo)本在水溶液中浸泡的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)使交聯(lián)結(jié)構(gòu)解體。因此，應(yīng)避免固定后的標(biāo)本在水溶液中浸泡的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；
②若用多聚甲醛固定懸浮細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)胞呈懸浮狀態(tài)，洗滌過(guò)程復(fù)雜，因此，應(yīng)注意離心時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)或轉(zhuǎn)速太高。一般用200×g離心5min。
在免疫染色實(shí)驗(yàn)中，如果可用的抗體使用效果均不佳，有三種方法可以使之改善。
先建議試用上述兩種固定方法，因?yàn)檫@兩種方法的固定機(jī)制存在很大區(qū)別�？贵w在一種固定方法中檢測(cè)效果不理想，有可能在另一種固定方法中工作良好。第二個(gè)解決問(wèn)題的方法是降低固定液的濃度，用系列稀釋的固定液進(jìn)行試驗(yàn)。下面選擇的方法雖然簡(jiǎn)單，但在非常低濃度固定液的情況下，仍能達(dá)到良好的固定效果。第三種方法是根據(jù)固定方法來(lái)制備抗體，先將抗原用固定液固定后，再去免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體。在這種情況下，所用抗原將和實(shí)驗(yàn)中固定后的抗原非常相似，能夠獲得結(jié)合固定抗原的抗體。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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