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用好的血清，細胞一定狀態(tài)良好？養(yǎng)細胞細心、體貼像照顧小孩紙，細胞一定「平平安安」？但 MTT 等一些細胞實驗結果卻異常。因為你的細胞已悄悄被支原體污染了。



支原體是一種生命力頑強的細菌，它和其他細菌的區(qū)別在于，支原體沒有細胞壁，只有柔軟的細胞膜。嬌小的身材（0.15-0.3μm）讓它可以輕松穿過濾器。由于身形小，培養(yǎng)物不會表現(xiàn)出渾濁或其他明顯可見的特征，因此支原體很容易被忽視。但支原體其實已經(jīng)隨著操作者的操作「偷偷地」?jié)撊氤瑑艄ぷ髋_，并附著在血球計數(shù)器、移液器、廢液缸等物體表面。
 

常見的支原體污染來源有：
1. 受污染的培養(yǎng)基、血清、或試劑
2. 不徹底的滅菌
3. 培養(yǎng)箱：目前常見的培養(yǎng)箱都帶有通氣扇和 CO2 瓶，在開、關內門的過程中，被支原體污染的顆粒會被擾動，可能造成細胞污染。其他實驗設備的使用也可能造成污染顆粒的擾動，如移液器、離心機等。
4. 液氮
液氮也可以成為傳播支原體的媒介。支原體具有頑強的生命力，即使沒有經(jīng)過低溫冷藏過程，支原體也可以在液氮里存活。在液氮中，支原體雖然不會增殖，但是仍可以污染保存在其中的細胞，因此建議將凍存管保存在液氮罐的氣相層中。
5. 空氣懸浮物
在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的懸浮顆粒是微生物污染的*主要來源，一些常見的儀器或普通的實驗操作都會產(chǎn)生這些顆粒，例如移液器、真空泵、離心機、冰箱等。攜帶微生物的顆粒直徑多在 4-28μm 之間，在靜止空氣中，它們以 30 cm/min 的速率移動，因此在密閉、不通風的房間或實驗室內，基本不會造成生物污染。但是，當實驗者進入房間時，沉積的顆粒會被擾動，懸浮起來的顆粒則有可能污染細胞。因此嚴格的無菌操作意識很重要。此外，實驗動物也會帶來一些被污染的懸浮顆粒。
除上述的情況外，濫用抗生素、密封不嚴、受污染細胞等也都可能是支原體污染的來源。
 

支原體污染的危害
1. 支原體導致細胞密度的減少，并引發(fā)細胞不可逆的退化。
2. 支原體吸收、破壞培養(yǎng)基中的精氨酸，抑制細胞生長、引發(fā)細胞凋亡，造成細胞活性降低、細胞脫落等現(xiàn)象 。更有甚者，也可能導致染色體畸變，因為精氨酸是細胞核內組蛋白的重要成分。
3. 支原體對 MTT 有還原作用，因此常規(guī)的細胞毒性實驗 MTT 實驗的結果會受到支原體的嚴重干擾；某些支原體也可以直接誘導樹突狀細胞的成熟，這對于人體免疫細胞的腫瘤治療來說，無疑是一個災難；除此之外，支原體的存在可以顯著改變數(shù)百個基因的表達水平。
由此可見，支原體不僅影響細胞的健康，也會影響細胞實驗的結果。因此，有必要定期檢測支原體。
建議在引進新細胞、凍存細胞前或發(fā)生細胞房污染等情況時，及時對細胞進行支原體檢測，平時對正常培養(yǎng)的細胞也有定期檢測的必要，以做到及時發(fā)現(xiàn)，及時處理，避免更大的損失。
 

防止污染的方法：
1. 改進無菌技術、嚴格無菌操作
對新進實驗室的人員，要由有經(jīng)驗的人員幫帶，嚴格監(jiān)督其實驗操作；此外建議記錄每一次的污染事件，以便分析解決污染問題。
2. 檢測外來細胞
因為外來的細胞攜帶污染很常見，因此，選擇可靠的細胞來源非常重要。
在沒有獨立細胞培養(yǎng)箱的情況下，可疑的細胞培養(yǎng)物應培養(yǎng)在帶蓋的培養(yǎng)瓶中，不要使用培養(yǎng)板或沒有密封的培養(yǎng)皿。此外，處理這類細胞應在一天工作都結束后進行，并且使用獨立的培養(yǎng)基和試劑，*后還要對超凈工作臺進行徹底除菌。
其他方面，如減少懸浮物產(chǎn)生、正確使用抗生素、定期進行支原體檢測等，對于防止污染也尤為重要。
 

支原體檢測
ExCell Bio 支原體檢測試劑盒針對支原體 DNA 用 PCR 檢測可疑樣本，其中 PCR 引物通常針對支原體的 16S rRNA 基因。在凝膠電泳過程中，支原體 DNA 會顯示為特異性條帶，以指示支原體的存在。
 

支原體檢測試劑盒特點：
靈敏度高：能夠檢測大于 10-20 拷貝的靶 DNA；
檢測范圍廣：涵蓋 54 種支原體，徹底排查污染；
普通 PCR 反應即可完成檢測，操作不復雜（TAKARA 用巢式 PCR 法、 lonza 用熒光檢測和熒光定量 PCR 等方法，操作復雜）；可排除假陰性：宿主陽性對照，結果更準確