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重組蛋白表達技術(shù)現(xiàn)已經(jīng)廣泛應用于生物學各個具體領(lǐng)域。特別是體內(nèi)功能研究和蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)都需要應用重組蛋白表達載體。

美國GeneCopoeia的蛋白表達載體按照表達宿主的不同新推出3類，分別為表達宿主為大腸桿菌，哺乳動物細胞的，以及慢病毒載體，宿主可以為哺乳動物細胞和原代細胞。

除了必要的復制和篩選的元件，協(xié)助表達和翻譯的元件外，本文將各類載體分別按照功能標簽的不同確定種類并將個標簽的功能初步介紹如下：

His6：

His6是指六個組氨酸殘基組成的融合標簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當某一個標簽的使用，一是能構(gòu)成表位利于純化和檢測；二是構(gòu)成獨特的結(jié)構(gòu)特征（結(jié)合配體）利于純化。組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析(IMAC)，對重組蛋白進行分離純化。

使用His-tag有下面優(yōu)點：

1.標簽的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分別為~26KD和~30KD，一般不影響目標蛋白的功能；

2.His標簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化，前者在純化疏水性強的蛋白得到應用，后者在純化包涵體蛋白時特別有用，用高濃度的變性劑溶解后通過金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復性不受其它蛋白的干擾，或進行金屬螯和親和層析復性；

3.His標簽融合蛋白也被用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究；

4.His標簽免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫制備抗體；

5.可應用于多種表達系統(tǒng)，純化的條件溫和；

6.可以和其它的親和標簽一起構(gòu)建雙親和標簽。

Flag:

Flag標簽蛋白為編碼8個氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時載體中構(gòu)建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達系統(tǒng)中表達效率更高。

FLAG作為標簽蛋白，其融合表達目的蛋白后具有以下優(yōu)點：

1.FLAG作為融合表達標簽，其通常不會與目的蛋白相互作用并且通常不會影響目的蛋白的功能、性質(zhì)，這樣就有利用研究人員對融合蛋白進行下游研究。

2.融合FLAG的目的蛋白，可以直接通過FLAG進行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，并且純化效率高。

3.FLAG作為標簽蛋白，其可以被抗FLAG的抗體識別，這樣就方便通過Western Blot、ELISA等方法對含有FLAG的融合蛋白進行檢測、鑒定。

4.融合在N端的FLAG，其可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。因此現(xiàn)FLAG標簽已廣泛的應用于蛋白表達、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關(guān)領(lǐng)域。

MBP:

MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白）標簽蛋白大小為40kDa，由大腸桿菌K12的malE基因編碼。MBP可增加在細菌中過量表達的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP標簽可通過免疫分析很方便地檢測。有必要用位點專一的蛋白酶切割標簽。如果蛋白在細菌中表達，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。

純化：融合蛋白可通過交聯(lián)淀粉親和層析一步純化。結(jié)合的融合蛋白可用10mM麥芽糖在生理緩沖液中進行洗脫。結(jié)合親和力在微摩爾范圍。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效結(jié)合，而其他融合蛋白則不受影響。 緩沖條件為pH7.0到8.5，鹽濃度可高達1M，但不能使用變性劑。如果要去除MBP融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。

檢測：可用MBP抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。

GST:

GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶) 標簽蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶，它的天然大小為26KD。將它應用在原核表達的原因大致有兩個，一個是因為它是一個高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一個是它可以在大腸桿菌中大量表達，起到提高表達量的作用。GST融合表達系統(tǒng)廣泛應用于各種融合蛋白的表達，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細胞中表達。結(jié)合的融合蛋白在非變性條件下用10mM 還原型谷胱甘肽洗脫。在大多數(shù)情況下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二體。GST標簽可用酶學分析或免疫分析很方便的檢測。標簽有助于保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性。在大多數(shù)情況下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。

純化：該表達系統(tǒng)表達的GST標簽蛋白可直接從細菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathionesepharose)親和樹脂進行純化。GST標簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會失去對谷胱甘肽樹脂的結(jié)合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強變性劑如：鹽酸胍或尿素等。

如果要去除GST融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。

檢測：可用GST抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。

HA:

HA標簽蛋白，標簽序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的紅細胞凝集素表面抗原決定簇，9個氨基酸，對外源靶蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響小, 容易構(gòu)建成標簽蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti－HA抗體檢測和ELISA檢測。

c-Myc:

C-Myc標簽蛋白，是一個含11個氨基酸的小標簽，標簽序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，這11個氨基酸作為抗原表位表達在不同的蛋白質(zhì)框架中仍可識別其相應抗體。C-Myc tag已成功應用在 Western-blot雜交技術(shù)、免疫沉淀和流式細胞計量術(shù)中, 可用于檢測重組蛋白質(zhì)在靶細胞中的表達。

eGFP/eCFP/eYFP/mCherry:

分別是增強型綠色熒光蛋白/增強型黃綠色熒光蛋白/增強型黃綠色熒光蛋白/單體紅色熒光蛋白,具有不同的激發(fā)波長發(fā)射波長為，均由野生型熒光蛋白通過氨基酸突變和密碼子優(yōu)化而來。就eGFP而言，相對于GFP，其熒光強度更強、熒光性質(zhì)更穩(wěn)定。同時載體中構(gòu)建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表達系統(tǒng)中表達效率更高。mCherry是從DsRed演化來的性能的一個單體紅色熒光蛋白，可以和GFP系列熒光蛋白共用，實現(xiàn)多色標記體內(nèi)、外實驗表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白時，熒光蛋白活性和被融合的目標蛋白功能相互沒有明顯影響。

這些熒光標簽蛋白，其融合表達目的蛋白后具有以下優(yōu)點：

1.不用破碎組織細胞和不加任何底物，直接通過熒光顯微鏡就能在活細胞中發(fā)出綠色熒光，實時顯示目的基因的表達情況，而且熒光性質(zhì)穩(wěn)定，被譽為活細胞探針。

2.其自發(fā)熒光，不需用目的基因的抗體或原位雜交技術(shù)就可推知目的基因在細胞中的定位等情況。

3.同時細胞內(nèi)的其它產(chǎn)物不會干擾標簽蛋白檢測，從而使其檢測更顯得快速、簡便、靈敏度高而且重現(xiàn)性。

4.其低消耗、高靈敏度檢測，十分適用于高通量的藥物篩選。因此現(xiàn)eGFP 表達標簽被廣泛地應用于基團表達調(diào)控、轉(zhuǎn)基因功能研究、蛋白在細胞中的功能定位、遷移變化及藥物篩選等方面。

5.mCherry紅色熒光蛋白在標記病毒顆粒，研究病毒和宿主細胞之間更有得天獨厚的優(yōu)勢。如用mRFP或mCherry標記HIV病毒顆粒，研究H1V和宿主細胞問的相互作用以及HIV侵染宿主細胞的過程．用mRFP標記慢病毒顆粒，研究慢病毒在小鼠體內(nèi)的復制過程等。

熒光素酶:

來源于生物體內(nèi)的熒光素，常見的有螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶和Guassia熒光素酶。這些熒光素酶作為“報告蛋白”被用于分子生物學研究中，這種技術(shù)被稱為報告基因檢測法或螢光素酶檢測法（Luciferase Assay）。跟普通融合蛋白標簽不同，使用熒光素酶構(gòu)建的報告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究啟動子、miRNA 3＇UTR克隆的功能與調(diào)控，因為它們對目的基因的調(diào)控可以是漸變的，而不是簡單的開和關(guān)兩種狀態(tài)。

優(yōu)點：靈敏度高，檢測幅度寬；不是哺乳動物細胞內(nèi)源性基因；重復性好；與HTS兼容等。螢火蟲和海腎熒光素酶已經(jīng)被廣泛應用于協(xié)同報告并進行均一化研究。由于它們都是快速，容易和高靈敏的監(jiān)測方法。而且螢火蟲和海腎熒光素酶是理想的雙基因報告系統(tǒng)，因為它們來源于不同的生物進化方向，蛋白結(jié)構(gòu)和底物差異都很大，在實驗中不會產(chǎn)生相互影響。

基于熒光素酶的特性，我司研發(fā)提供的Secrete-Pair? Dual Luminescence Assay Kit可用于分析雙報告系統(tǒng)中Gaussia熒光素酶（GLuc）和分泌型堿性磷酸酶(SEAP)活性。GLuc 和SEAP均為分泌型報告蛋白，無需裂解細胞即可便捷的從細胞培養(yǎng)液中取得樣本，并對實驗結(jié)果進行精準的實時分析。

Avi Tag:

AviTag標簽蛋白是一個15 個氨基酸的短肽，具有一個單生物素化賴氨酸位點，與已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目標蛋白的N端和C端。融合表達后，可被生物素連接酶生物素化，為了純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白質(zhì)分離純化，還用于蛋白質(zhì)相互作用研究。

Avi Tag標簽系統(tǒng)具有以下幾大優(yōu)點:

1.無論在體外或者體內(nèi)，幾乎所有的蛋白都可以在一個獨特的Avi Tag位點輕易且有效地被生物素化；

2.生物素化是通過酶和底物的反應來實現(xiàn)，反應條件相當溫和而且標記的專一性極高；

3.生物素AviTag只有15個氨基酸，對蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響非常小。

SNAP-Tag:

SNAP-Tag是新一代的蛋白標簽技術(shù)，不僅專一性極高而且穩(wěn)定，的優(yōu)點是適用于多種環(huán)境下的蛋白質(zhì)檢測與純化，如活細胞內(nèi)、溶液中、或固態(tài)相(如SDS-PAGE gels)等。

SNAP-Tag是從人的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）獲得。無論體內(nèi)還是體外，SNAP-Tag都能與底物高特異性地共價結(jié)合，使蛋白標記上生物素或熒光基團（如熒光素和若丹明）。SNAP所帶的活性巰基位點接受了苯甲基鳥嘌呤所攜帶的側(cè)鏈苯甲基基團，釋放出了鳥嘌呤。這種新的硫醚鍵共價結(jié)合使SNAP所帶的目的蛋白攜帶上了苯甲基基團所帶的標記物。苯甲基鳥嘌呤在生化條件下穩(wěn)定，并且沒有其他蛋白會和這類物質(zhì)作用，所以SNAP標簽反應是高特異的。

檢測：生物素或各種顏色熒光的底物（如熒光素、若丹明）可滲透進入細胞，方便快捷地進行活細胞內(nèi)SNAP-Tag融合蛋白的標記與檢測。它們也可特異性地標記大腸桿菌，酵母和哺乳動物等細胞抽提液或已經(jīng)純化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。

將純化的或未純化的SNAP-Tag融合蛋白與表面固定了苯甲基鳥嘌呤的基質(zhì)混合，蛋白即可特異與底物作用，形成共價鍵，融合蛋白間接被固定在了基質(zhì)表面上，可以達到更方便快捷地研究蛋白功能或純化蛋白的目的。

Halo Tag:

HaloTag?標簽蛋白是一種脫鹵素酶的遺傳修飾衍生物，可與多種合成的HaloTag?配基有效地共價結(jié)合。這個分子量為33KDa的單體蛋白能融合在重組蛋白的N端或C 端，并在原核和真核系統(tǒng)中表達。

HaloTag?配基是小分子化學物，能夠在體外或體內(nèi)與HaloTag?蛋白共價結(jié)合。這些配基由兩個關(guān)鍵組分組成：(1)一個通用的HaloTag?反應聯(lián)結(jié)子，結(jié)合HaloTag?蛋白；(2)一個功能基團,例如熒光染料或親和媒介。

能夠共價和特異性結(jié)合多種合成的報告基團和親和配基的特性，使得HaloTag?蛋白能夠用于檢測和親和結(jié)合或固相化固定目的蛋白。

SUMO:

SUMO標簽蛋白是一種小分子泛素樣修飾蛋白（Small ubiquitin-likemodifier），是泛素(ubiquitin)類多肽鏈超家族的重要成員。在一級結(jié)構(gòu)上，SUMO與泛素只有18%的同源性，然而兩者的三級結(jié)構(gòu)及其生物學功能卻十分相似。

研究發(fā)現(xiàn)SUMO可以作為重組蛋白表達的融合標簽和分子伴侶，不但可以進一步提高融合蛋白的表達量，且具有抗蛋白酶水解以及促進靶蛋白正確折疊，提高重組蛋白可溶性等功能。

此外SUMO還有一項重要的應用，就是可用于完整地切除標簽蛋白，得到天然蛋白。因為SUMO蛋白水解酶（我公司可提供）能識別完整的SUMO標簽蛋白序列，并能高效地把SUMO從融合蛋白上切割下來。切除SUMO后，經(jīng)過親和層析，去除標簽蛋白部分，就得到和天然蛋白一樣的重組蛋白。所以SUMO標簽也常用于和其他標簽一起應用，作為特異酶切水解位點。