質(zhì)粒ＤＮＡ小量制備的問(wèn)題與對(duì)策：
裂解和煮佛法都極其可靠，重復(fù)性也很好，而且一般沒(méi)有會(huì)么麻煩。多年來(lái)，在我們實(shí)驗(yàn)室中日常使用這兩種方法的過(guò)程中，只碰到過(guò)兩個(gè)問(wèn)題：
１）有些工作者首次進(jìn)行小量制備時(shí)，有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA不能被限制酶所切割，這幾乎總是由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時(shí)注意得不夠。大多數(shù)情況下，用酚：氯仿對(duì)
溶液進(jìn)行抽提可以去除小量備物中的雜質(zhì)。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化DNA。
２）在十分偶然的情況下，個(gè)別小時(shí)制備物會(huì)出現(xiàn)無(wú)質(zhì)粒DNA的現(xiàn)象。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去。
三、質(zhì)粒ＤＮＡ的大量制備
在豐富
培養(yǎng)基中擴(kuò)增質(zhì)粒
細(xì)菌的收獲和裂解
收獲
堿裂解法
（一）在豐富培養(yǎng)基中擴(kuò)增質(zhì)粒
許多年來(lái)，一直認(rèn)為在氯霉素存在下擴(kuò)增質(zhì)粒只對(duì)生長(zhǎng)在基本培養(yǎng)基上的細(xì)菌有效，然而在帶有pMBl或ColEl復(fù)制子的高拷貝數(shù)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中，采用以下步驟可提高產(chǎn)量至每500ml培養(yǎng)物2－5mg質(zhì)粒DNA，而且重復(fù)性也很好。
１）將30ml含有目的質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物培養(yǎng)到對(duì)數(shù)晚期（DNA 600約0.6)。培養(yǎng)基中應(yīng)含有相應(yīng)抗生素，用單菌落或從單菌落中生長(zhǎng)起來(lái)的小量液體閉關(guān)物進(jìn)行接種。
２）將含相應(yīng)抗生素的500ml ＬＢ或Terrific肉湯培養(yǎng)基（預(yù)加溫至37℃）施放入25ml對(duì)數(shù)晚期的培養(yǎng)物，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)25小時(shí)（搖床轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分），所得培養(yǎng)物的OD 600值約為0.4。
３）可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇），使終濃度為170μg/ml。像pBR322一類在宿主菌內(nèi)只以中等拷貝婁竿行復(fù)的質(zhì)粒，有必要通過(guò)擴(kuò)增。這些質(zhì)粒只要從生長(zhǎng)達(dá)到餉新一代的質(zhì)粒（如pUC質(zhì)粒）可復(fù)制達(dá)到很高的拷貝數(shù)，因此無(wú)需擴(kuò)增。這些質(zhì)粒只要從生長(zhǎng)達(dá)到飽和的細(xì)菌培養(yǎng)物即可大量提純。但用氯霉素進(jìn)行處理，具有抑制細(xì)菌復(fù)制的優(yōu)點(diǎn)，可減少細(xì)菌裂解物的體積和粘稠度，極大地簡(jiǎn)化質(zhì)粒純化的過(guò)程。所以一般說(shuō)來(lái)，盡管要在生長(zhǎng)中的細(xì)菌培養(yǎng)物里加入氯霉素略顯不便，但用氯霉素處理還是利大于弊。
４）于37℃劇烈振搖（300轉(zhuǎn)/分），繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時(shí)。
（二）細(xì)菌的收獲和裂解
１．收獲
１）用合適轉(zhuǎn)頭于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清，敞開(kāi)離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。
２）將細(xì)菌沉淀重懸于100ml用冰預(yù)冷的STE中。
STE
0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
２）按步驟１）所述方法離心，以收集細(xì)菌
細(xì)胞。
２，堿裂解法
１）將冼過(guò)的500ml 培養(yǎng)物的細(xì)菌沉淀物[ 來(lái)自收獲細(xì)菌的步驟3] 重懸于10ml（18ml）溶液Ｉ中。
溶液Ｉ
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
10mmol/L EDTA(pH8.0)
溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于４℃。
２）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。當(dāng)溶液的pH值低于8.0時(shí)，溶菌酶不能有效工作。
３）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH(臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋）
1％SDS
蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物。于室溫放置5-10分鐘。
４）加15nl(20ml)用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ
5mol/L乙酸鉀 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
所配成的溶液對(duì)鉀是３mol/L，對(duì)乙酸根是5mol/L。
封住瓶口，搖動(dòng)離心瓶數(shù)次以混勻內(nèi)容物，此時(shí)應(yīng)不再出現(xiàn)分明的兩個(gè)液相。置冰上放10分鐘，應(yīng)形成一白色絮狀沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀應(yīng)包括染體DNA、 高分子量RNA和鉀－SDS－
蛋白質(zhì)－膜復(fù)合物。
５）用合適轉(zhuǎn)頭于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，不開(kāi)剎車而使轉(zhuǎn)頭自然停轉(zhuǎn)。如果細(xì)菌碎片貼壁不緊，可以5000轉(zhuǎn)/分再度離心20分鐘， 然后盡可能將上清全部轉(zhuǎn)到另一瓶中，棄去殘留在離心管內(nèi)的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊的原因通常是由于溶液Ⅲ與細(xì)菌裂解物混合不充分[步驟４）]。
６）上清過(guò)濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。
７）用合適轉(zhuǎn)頭于室溫以500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，回收核酸。如于4℃離心，鹽也會(huì)了生沉淀。
８）小心倒掉上清，敞開(kāi)瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70％乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯(lián)的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使*后殘余的痕量乙醇揮殆盡。
９）用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。
10）純化。
四、質(zhì)粒ＤＮＡ的純化
聚乙二醇沉淀法質(zhì)粒ＤＮＡ
氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)ＤＮＡ
（一）聚乙二醇沉淀法提取質(zhì)粒ＤＮＡ
１）將核酸溶液所得]轉(zhuǎn)入15mlＣorex 管中， 再加3ml 用冰預(yù)冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，用合適轉(zhuǎn)頭于４℃下以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子RNA。
２）將上清轉(zhuǎn)移到另一30mlCorex管內(nèi)，加等量的異丙醇， 充分混勻， 用SorvallSS34轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)尖）于室溫以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分釧， 回收沉淀的核酸。
３）小心去掉上清，敞開(kāi)管口，將管倒置以使*后殘留的液滴流盡。于室溫用70％乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開(kāi)管口并將管侄置，在紙巾上放置幾分鐘，以使*后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
４）用500μl含無(wú)DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml ）的TE（pH8.0）溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。
５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量
離心機(jī)于４℃以12000g離心５分鐘，以回收質(zhì)粒ＤＮＡ。
６）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解質(zhì)粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。
７）將水相轉(zhuǎn)到另一微量離心管中，加100μl 10mol/L乙醇銨，充分混勻，加２倍體積（約1ml）乙醇，于室溫放置10分鐘，于4℃以12 000g離心5分鐘，以回收沉淀的質(zhì)粒ＤＮＡ。
８）吸去上清，加200μl處于4℃以12 000g離心2分鐘。
９）吸去上清，敞開(kāi)管口，將管置于實(shí)驗(yàn)桌上直到*后可見(jiàn)的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
10）用500μl TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀釋[用TE（pH8.0)] 后測(cè)量OD 260，計(jì)算質(zhì)粒DNA的濃度（1OD260＝50μg質(zhì)粒DNA/ml）， 然后將DNA貯于－20℃。
（二）氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)ＤＮＡ
此方法可獲的較高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，但耗時(shí)且費(fèi)用昂貴目前較少采用，這里不多綴述。
客服一
