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PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們有時(shí)候會(huì)遇到目的基因得率低，或者根本擴(kuò)不出來的情況，不管是PCR的實(shí)驗(yàn)王者，還是初級(jí)實(shí)驗(yàn)小白，都需要逐個(gè)排查問題，那么我們需要考慮哪些因素呢？

今天這一篇干貨，幫您徹底解決問題。
 

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首先考慮的問題，是不是DNA模板的問題呢？

1. 如果模板質(zhì)量太差？

那么檢查DNA模板的純度和完整度，保證你的模板中不含有PCR抑制劑。在分離DNA時(shí)，盡量減少對(duì)DNA的切斷或切刻。如有需要，可通過凝膠電泳檢測(cè)模板DNA完整性。

將DNA保存于分子級(jí)別的水或TE緩沖液 （pH 8.0）中，防止被核酸酶降解。

2. 如果是模板濃度太低？

建議使用DNA純化試劑盒分離模板DNA時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵循試劑盒生產(chǎn)商的建議。查閱用戶手冊(cè)和疑難問題指南，改善較低的DNA質(zhì)量。如果采用化學(xué)或酶促DNA純化方案，應(yīng)確保無PCR抑制劑殘留，如苯酚、EDTA和蛋白酶K。使用70%乙醇再純化或沉淀和洗滌DNA，去除可能會(huì)抑制DNA聚合酶的殘留鹽分或離子（如， K⁺, Na⁺等）。選擇具有高合成能力的DNA聚合酶，這類聚合酶對(duì)土壤、血液和植物組織攜帶的常見PCR抑制劑具有較好的耐受性。

3. 如果是DNA模板量不足？

建議檢查 DNA起始量 ，如有需要適當(dāng)增加起始量。 選擇具有高靈敏度 的DNA聚合酶用于擴(kuò)增。適當(dāng)增加PCR循環(huán)數(shù)。

4. 如果需要擴(kuò)增的目的片段比較復(fù)雜（如，高GC含量或含二級(jí)結(jié)構(gòu)）？、

建議選擇具有相應(yīng)的擴(kuò)增試劑盒，比如適合高GC含量片段的PCR試劑盒�；蛘哌x擇具有高合成能力的DNA聚合酶，這類酶對(duì)DNA模板的親和力較高，更適合擴(kuò)增困難靶標(biāo)。 使用 PCR添加劑或輔助溶劑 ，促進(jìn)富含GC的DNA和具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列變性。增加 變性時(shí)間或溫度 ，從而高效解離雙鏈DNA模板。

5. 如果目的片段太長(zhǎng)？

建議直接使用長(zhǎng)片段設(shè)計(jì)的PCR試劑盒，或者確認(rèn)所選DNA聚合酶的長(zhǎng)片段擴(kuò)增能力。使用專為 長(zhǎng)片段PCR設(shè)計(jì)的DNA聚合酶。選擇具有高合成能力的DNA聚合酶，這類酶能夠在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增長(zhǎng)片段。降低退火和延伸溫度，促進(jìn)引物結(jié)合和提高酶熱穩(wěn)定性。根據(jù)擴(kuò)增子長(zhǎng)度，增加延伸時(shí)間。

或者是引物的問題？

6. 考慮引物濃度是不是不是*優(yōu)的？

建議預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化引物濃度（范圍通常為0.1–1 μM）。對(duì)于長(zhǎng)片段PCR和使用簡(jiǎn)并引物的PCR，*小起始濃度為 0.5μM。

7. 引物設(shè)計(jì)有問題？

可以使用多種引物設(shè)計(jì)軟件比如Primer Premier等，或者使用在線 引物設(shè)計(jì)工具 。確保引物針對(duì)目的片段具有特異性。 確認(rèn)引物與正確的目標(biāo)DNA鏈互補(bǔ)。

也許是其他試劑的問題？

8. MgCl2 濃度太低？

鎂離子（Mg²⁺）作為DNA聚合酶活性的輔助因子，有助于聚合期間dNTP的結(jié)合。酶活性位點(diǎn)處的鎂離子可催化引物的3′-OH與dNTP的磷酸基團(tuán)間形成磷酸二酯鍵。此外， Mg²⁺ 能夠穩(wěn)定磷酸鹽骨架上的負(fù)電荷，從而促進(jìn)引物與DNA模板形成復(fù)合物。在PCR中，標(biāo)準(zhǔn)的 Mg²⁺ 終濃度范圍為1–4 mM，建議優(yōu)化滴定增量為0.5 mM。 Mg²⁺ 濃度過低會(huì)降低聚合酶活性，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物較少或無PCR產(chǎn)物。另一方面， Mg²⁺ 濃度過高則會(huì)提高引物-模板復(fù)合物的穩(wěn)定性，產(chǎn)生非特異性PCR產(chǎn)物，并增加由dNTP錯(cuò)誤插入導(dǎo)致的復(fù)制錯(cuò)誤。

還有可能是PCR循環(huán)設(shè)置不理想呢？

9. 變性效果不理想？

建議優(yōu)化DN變性時(shí)間和溫度。變性時(shí)間短、溫度低可能無法獲得良好的雙鏈DNA模板解離效果。相反，變性時(shí)間長(zhǎng)、溫度高可能會(huì)降低酶活性。

10. 退火效果不理想？

盡量使用 梯度熱循環(huán)儀 ，以1–2°C增量逐步優(yōu)化退火溫度。*佳退火溫度通常比引物Tm低 3–5°C。當(dāng)使用 PCR 添加劑或輔助溶劑 時(shí)，應(yīng)調(diào)整退火溫度。使用指定DNA聚合酶在其*佳緩沖液中的 推薦退火溫度 。DNA聚合酶不同，則引物對(duì)的退火溫度也不同。

11. 延伸效果不理想？

選擇適合于擴(kuò)增子長(zhǎng)度的延伸時(shí)間。

在擴(kuò)增長(zhǎng)片段（如，>10 kb）時(shí)，降低延伸溫度（如，降至68°C）可保持酶活性。

使用具有 高合成能力 的DNA聚合酶，在較短的延伸時(shí)間內(nèi)也能實(shí)現(xiàn) 穩(wěn)定的擴(kuò)增 。

12. PCR循環(huán)數(shù)不合適？

調(diào)整循環(huán)數(shù)（通常為23-35個(gè)循環(huán)），以獲得合適的PCR產(chǎn)物得率。如果DNA起始量低于10拷貝，則將循環(huán)數(shù)增加至40。