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引物修飾的常見(jiàn)類(lèi)型及應(yīng)用
閱讀次數(shù)：783 發(fā)布時(shí)間：2020/7/6 10:47:22

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脫氧次黃嘌呤（deoxyInosine，dI）：
脫氧次黃嘌呤是一個(gè)自然存在的堿基，雖然不是真正意義上的通用堿基但當(dāng)與其它堿基結(jié)合時(shí)會(huì)比其它堿基錯(cuò)配相對(duì)更穩(wěn)定。脫氧次黃嘌呤與其它堿基的結(jié)合能力為dI:dC > dI:dA > dI:dG > dI:dT. 在DNA聚合酶的催化下，脫氧次黃嘌呤與dC結(jié)合。

脫氧脲嘧啶（DeoxyUridine，dU）：
脫氧脲嘧啶可以插進(jìn)寡核苷酸來(lái)增加雙鏈的熔點(diǎn)溫度從而增長(zhǎng)雙鏈的穩(wěn)定性。每個(gè)脫氧胸腺嘧啶被脫氧脲嘧啶替代可以增長(zhǎng)雙鏈熔點(diǎn)溫度1.7 ℃。

硫代（Phosphorothioate，S-oligos）：
S-oligos是寡核苷酸中單核苷酸間的磷酸二酯鍵中的一個(gè)氧被硫代替后形成的，堿基被添加上后，再進(jìn)行連接修飾。兩個(gè)堿基之間的磷酸可以轉(zhuǎn)換成雙鍵"S"(用硫代試劑）代替普通的雙鍵"O"（用碘溶液）。
硫代修飾的寡核苷酸主要用于反義實(shí)驗(yàn)中防止被核酸酶降解。您可以選擇全硫代，但隨著硫代堿基的增加，寡核苷酸的Tm值會(huì)降低，為了降低這種這種影響，可以對(duì)引物兩端2-5個(gè)堿基進(jìn)行硫代修飾，通�？梢赃x擇5＇和3＇各3個(gè)堿基進(jìn)行硫代修飾。

磷酸化（Phosphorylation）：
5＇磷酸化是通過(guò)B-氰乙基化學(xué)反應(yīng)添加到引物5＇端的糖環(huán)上，而不是*后一個(gè)堿基上�？捎糜诮宇^、克隆和基因構(gòu)建以及連接酶催化的連接反應(yīng)；在可抗外切酶消化的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA鏈延伸反應(yīng)。

內(nèi)部氨基修飾：
主要用C6-dT aminolinker來(lái)加到胸腺嘧啶殘基上來(lái)進(jìn)行內(nèi)部修飾。修飾后氨基與主鏈相距10個(gè)原子距離，可用于進(jìn)一步的標(biāo)記和酶連接（如堿性磷酸酶）。

5＇氨基修飾：
5＇Aminolinker(C6)是在合成循環(huán)的*后一步以亞磷酸胺的形式通過(guò)B-氰乙基化學(xué)反應(yīng)添加到引物5＇糖環(huán)上的，而不是添加到*后一個(gè)堿基上。5＇ C6氨基修飾可用于制備功能化的寡核苷酸，廣泛應(yīng)用在DNA芯片（DNA Microarray）和多重標(biāo)記診斷系統(tǒng)，目前主要用于連接一些即便靠近寡核苷酸也不會(huì)影響其功能的化合物。

3＇氨基修飾：
目前提供3＇C7氨基修飾，它可用于設(shè)計(jì)新的診斷探針和反義核苷酸，例如5＇端可用高度敏感的32P或熒光素標(biāo)記的同時(shí)3＇可用氨基修飾以進(jìn)行其他的連接。此外，3＇修飾可以抑制3＇外切酶酶解，從而可用于反義實(shí)驗(yàn)。

巰基（Thiol）：
5＇-巰基在很多方面與氨基修飾類(lèi)似。巰基可用于加附各種修飾如熒光標(biāo)記物和生物素。例如可在碘乙酸和馬來(lái)酰亞胺衍生物存在下制作巰基連接的熒光探針。 5＇巰基修飾主要用5＇巰基修飾單體（5＇-Thiol-Modifier C6-CE Phosphoramidite 或Thiol-Modifier C6 S-S CE Phosphoramidite），用5＇-Thiol-Modifier C6-CE單體修飾后必須進(jìn)行硝酸銀氧化以去除保護(hù)基（trityl），而Thiol-Modifier C6 S-S CE單體修飾后須用DTT將二硫鍵還原成巰基。

生物素（Biotin）：
生物素修飾的寡核苷酸能緊緊地結(jié)合在鏈霉親和素蛋白上，鏈霉親和素蛋白可以標(biāo)記上熒光染料和酶或作為附著的中間結(jié)合物附著在固體物生物表面，不同的分子生物學(xué)和純化方法都包含生物素修飾。生物素修飾可以利用C6或是TEG間臂被添加在寡核苷酸的5’或末端，生物素TEG需要純化，中間的生物素修飾可以通過(guò)dT堿基加入，這種形式需要更多的純化步驟。引物生物素標(biāo)記，可用于非放射性免疫分析來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)、胞內(nèi)化學(xué)染色、細(xì)胞分離、核酸分離、雜交檢測(cè)特異性的DNA/RNA序列、離子通道構(gòu)象變化等。

地高辛（Digoxigenin）：
地高辛是一種從毛地黃植物分離出來(lái)的類(lèi)固醇物質(zhì)，因?yàn)槊攸S植物的花和葉子是這種物質(zhì)自然來(lái)源，所以抗地高辛抗體不會(huì)結(jié)合到其他生物物質(zhì)。地高辛經(jīng)由一個(gè)11個(gè)原子的間臂連接到脲嘧啶的C5位置。雜交的地高辛探針可以由抗地高辛抗體來(lái)檢測(cè)，這個(gè)抗體一般會(huì)與堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、熒光素或膠體金偶連�；驔](méi)有偶連的抗地高辛抗體但偶連的抗體。地高辛標(biāo)記的探針可用于各種雜交反應(yīng)，如DNA-DNA雜交（Southern blotting）、DNA-RNA雜交（Northern blotting）、斑點(diǎn)雜交（Dot blotting ）、克隆雜交、原位雜交及酶聯(lián)免疫分析（ELISA）。

間臂（Spacer）：
Spacer可為寡核苷酸標(biāo)記提供必要的間隔以減少標(biāo)記基團(tuán)與寡核苷酸間的相互作用，主要應(yīng)用于DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)和雙鏈結(jié)構(gòu)研究。 C3 spacer主要用于模仿核糖的3＇和5＇羥基間的三碳間隔，或“替代”一個(gè)序列中未知的堿基。 3＇-Spacer C3用于引進(jìn)一個(gè)3＇間臂從而阻止3＇端外切酶和3＇端聚合酶發(fā)揮作用。 Spacer 18常用于引進(jìn)一個(gè)強(qiáng)疏水基團(tuán)。