目的
研究基因的表達和調(diào)控時，需要從組織或細胞中分離純化RNA。RNA質(zhì)量的高低常常影響RT- PCR、cDNA庫構建和Northern Blot等分子生物學實驗的成敗。
主要試劑：Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細胞，抑制細胞釋放出 的核酸酶。
1. Trizol試劑含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。
2. RNase污染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉，注意配帶手套，樣品盡可能蓋嚴；
3. 細胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全會降低后得率，因為一部分RNA會殘留在未裂解的細胞中。細胞裂解之后要看不見顆粒狀物質(zhì)（結締組織和骨除外）。在清洗和裂解細胞時好在低溫下操作，防止在操作過程中釋放的內(nèi)源RNase降解了RNA。
4. 酵母和一些細菌由于細胞壁的特殊結構，可以加入Trizol試劑同時加入無RNase的玻璃珠并劇烈振蕩，使細胞裂解充分。
2-8℃ 避光保存一年。
準備工作
RNA酶（Rnase）是導致RNA降解主要的物質(zhì)。此酶非常穩(wěn)定，在一些端的條件下只可暫時失活，但限制因素去除后又迅速恢復活性。常規(guī)高溫高壓滅菌方法和
蛋白抑制劑不能使所有的Rnase完全失活。
1.它廣泛存在于人的皮膚上，因此制備RNA時必須戴2.手套RNase的又一污染源是取液器。根據(jù)取液器制造
商的要求對取液器進行處理。一般情況下采用以DEPC配制的%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部，可基本達到要求。
3. 塑料制品、玻璃和金屬物品的處理
（1）塑料制品：盡量使用一次性無菌塑料制品。已標明RNase-free的塑料制品，如沒有開封使用過，通常不必再處理。
處理的步驟如下：
Ø在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使其終濃度為 0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二乙基焦碳酸酯為活性很強的劇毒物，須在通風櫥中小心使用）
Ø 將待處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通風柜中 37℃ 或室溫下處理過夜。
Ø 將DEPC-H2O小心倒入廢液瓶中，將裝有DEPC- H2O 處理過的塑料制品的容器以鋁箔封口，高溫高壓蒸 汽滅菌至少30分鐘。
Ø 滅菌塑料制品烘烤干燥，置潔凈處備用。
（2）玻璃和金屬物品250 ℃烘烤3小時以上。
DEPC(二乙基焦碳酸酯)
ØDEPC是RNA酶的化學修飾劑,它和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應而抑制酶活性。
ØDEPC與氨水溶液混合會產(chǎn)生致癌物,因而使用時需小心。
Ø試驗所用試劑也可用DEPC處理,加入DEPC至0.1%濃度,然后劇烈振蕩10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。
Ø但DEPC能與胺和巰基反應,因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。
實驗步驟如下：
1. 取50~100mg的組織,加入1 ml Trizol試劑，用勻漿器打勻(Trizol 先放于冰上)。
2. 將勻漿室溫放置5 min。
3. 加入200 μl 氯仿,劇烈震蕩混勻 30s，冰上靜置3 min。
4. 12000 rpm，4℃ 離心15 min。
5. 將上清液小心轉移到新的 1.5 ml離心管中（取400 μl ），加入等量體積的異丙醇，上下顛倒幾次混勻，室溫下放置15 min。（此步中注意：不要吸取任何中間層物質(zhì)，寧缺勿爛。）
6. 12000 rpm， 4℃ 離心15 min 。
7. 小心移去上清液，防止RNA沉淀丟失。
8. 用70%乙醇（DEPC處理的水配制）洗滌1次，加入700 μl乙醇，將RNA沉淀彈起，漂洗。（此時RNA是不溶解的）
9. 8000 rpm，室溫離心10min。
10. 盡可能徹底地吸走上清，防止RNA沉淀丟失。
11. 真空離心干燥3~5分鐘，或放在室溫下使乙醇完全揮發(fā)掉。
12. 沉淀用30 μl DEPC-H2O溶解。如發(fā)現(xiàn)沉淀難溶，68 ℃處理10 min。
13. RNA檢測
(1) 測定樣品在260 nm和280 nm的吸光值 按1OD=40 μg/ ml RNA計算RNA的產(chǎn)量。
OD260/OD280 在1.8-2.0 。
(2)進行甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳,確定RNA的完整性和污染情況。
低得率
A．樣品裂解或勻漿處理不徹底
B．后得到的RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65
A．檢測吸光度時，RNA樣品不是溶于TE，而 是溶于水。低離子濃度和低pH條件下，A280值會較高。
B．樣品勻漿時加的試劑量太少。
C．勻漿后樣品未在室溫放置5分鐘。
D．水相中混有有機相。
E．后得到的RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解
A．組織取出后沒有馬上處理或冷凍
B．樣品或提取的RNA沉淀保存于-5－-20℃，未在-60－-70℃保存。
C．細胞在胰酶處理時被破壞。
D．溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理。
客服一
