細胞培養(yǎng)基（cell culture medium）是人工模擬動物細胞的體內(nèi)生長環(huán)境，維持體外細胞存活和增殖的營養(yǎng)物質(zhì)基礎(chǔ)，其主要功能是為細胞提供適宜的pH和滲透壓，以及細胞本身不能合成的各種營養(yǎng)物質(zhì)。本文將對細胞培養(yǎng)基的種類、成分及理化性質(zhì)，以及相關(guān)問題等方面進行介紹。
細胞培養(yǎng)基的種類按照細胞培養(yǎng)基的發(fā)展歷史，細胞培養(yǎng)基大致可分為平衡鹽溶液、天然細胞培養(yǎng)基、合成細胞培養(yǎng)基、無血清細胞培養(yǎng)基、限定化學成分細胞培養(yǎng)基等幾大種類。
1.1 平衡鹽溶液（balanced salt solution，BSS）
BSS主要是由無機鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。其主要用于細胞的漂洗、配制其他試劑等。幾種常用的BSS配方如下（表1-1）。
D-Hank＇s與Hank＇s的一個主要區(qū)別是者不含有Ca2+和Mg2+，因此D-Hank＇s常用于配制胰酶溶液。因為Ca2+、Mg2+是細胞膜的重要組成成份，參與細胞粘附等功能，使用不含Ca2+、Mg2+的BSS可避免細胞結(jié)團。此外，Hanks液和Earle液是常用的BSS基礎(chǔ)溶液，者緩沖能力較弱，適合于密閉培養(yǎng)；后者緩沖能力較強，適合于5% CO2的培養(yǎng)條件。
表1-1 幾種常用的BSS配方（g/L）
1.2 天然細胞培養(yǎng)基
天然培養(yǎng)基指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。其優(yōu)點是營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果良好，但缺點是成分復(fù)雜，來源受限且制作過程復(fù)雜、批間差異大。目廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細胞也是必不可少。
水解乳
蛋白是乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含豐富的多肽、氨基酸和碳水化合物。一般配制成0.5 %溶液（采用平衡鹽溶液溶解）與合成培養(yǎng)基（如MEM細胞培養(yǎng)基）以1:1的比例混合使用。
目用于細胞培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。牛血清對絕大多數(shù)哺乳動物細胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細胞時使用其他動物血清更合適。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，這些物質(zhì)對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。此外，血清含一些對細胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應(yīng)（如精胺、亞精胺）形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、
抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡。目，血清多作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為5 ~ 20 %，常用是10 %。
由于水解乳蛋白和血清成份復(fù)雜，批間差異大及存在病毒等外源污染風險，對下游生物制品的分離純化和安全性都存在較大的影響，在生物制藥行業(yè)的使用也越來越少。因此，基于對血漿成份的分析，合成細胞培養(yǎng)基應(yīng)運而生。
1.3 合成細胞培養(yǎng)基
合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學物質(zhì)模擬合成、人工設(shè)計、配制的培養(yǎng)基。早開發(fā)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（minimal essential medium, MEM），其本質(zhì)為含有鹽、氨基酸、維生素和其他必需營養(yǎng)物的pH緩沖的等滲混合物。在此基礎(chǔ)上，DMEM、IMDM 、HAM F12、PRMI1640等各種合成細胞培養(yǎng)基被不斷開發(fā)出來。常用合成培養(yǎng)基的配方此處不詳細介紹，其特性及應(yīng)用的范圍見表1-2。
表1-2 常用合成培養(yǎng)基的特性及應(yīng)用的范圍
與天然培養(yǎng)基相比，有些天然的未知成分尚無法用已知的化學成分所替代，因此，細胞培養(yǎng)中使用合成培養(yǎng)基時必須加入一定量的天然培養(yǎng)基成分，以克服合成培養(yǎng)基的不足。普遍的做法是添加5 ~ 10 %的血清，這樣才能維持細胞活力，促進細胞增殖。針對不同的動物細胞，現(xiàn)已開發(fā)了多種商業(yè)化、個性化的低血清細胞培養(yǎng)基配方，營養(yǎng)成份更加豐富，血清使用量可降低至1～3 %，由此可減少了血清等動物來源成份對生物制品安全性的影響。
1.4 無血清細胞培養(yǎng)基（serum free medium，SFM）
經(jīng)歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)成為當細胞培養(yǎng)域的一大趨勢。采用無血清培養(yǎng)可降低生產(chǎn)成本，簡化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害。無血清培養(yǎng)基，一般是在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入成份完全明確的或部分明確的血清替代成份，達到既能滿足動物細胞培養(yǎng)的要求，又能有效克服使用血清所帶來問題的目的。
無血清培養(yǎng)基中通常需要添加一些額外的組分，才能幫助細胞貼壁生長，包括以下幾大類物質(zhì)：1）促貼壁物質(zhì)：一般為細胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進來自中胚層細胞的貼壁與分化，這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質(zhì)細胞、CHO細胞、成肌細胞等。
2）促生長因子及激素：針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細胞必不可少的，如胰島素。
3）酶抑制劑：培養(yǎng)貼壁生長的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養(yǎng)基中需含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。常用的是大豆胰酶抑制劑。
4）結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白：常見如轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加量比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護細胞免受機械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。
5）微量元素：硒是常見的。
1.5 無蛋白無血清細胞培養(yǎng)基與化學組份限定無血清細胞培養(yǎng)基
1）無蛋白無血清細胞培養(yǎng)基（protein free midium, PFM）
這類培養(yǎng)基完全不含有動物來源蛋白，但仍有部份添加物是植物蛋白的小水解片段或合成多肽片段，以及類固醇激素和脂類體等，以替代動物激素、生長因子的作用。其特點是完全沒有蛋白或蛋白含量低，有利于生物制品的分離純化。
2）化學組份限定無血清細胞培養(yǎng)基（Chemically defined media, CDM）
此類培養(yǎng)基是目安全、為理想的無血清細胞培養(yǎng)基，所有成份的濃度都完全明確，即使其所添加的少量蛋白，也是可經(jīng)過純化處理，成份明確、濃度確定的蛋白。這類培養(yǎng)基較為理想地減少了生產(chǎn)的可變性，提高了生產(chǎn)工藝的重復(fù)性，并有效降低了純化成本。
1.6 個性化細胞培養(yǎng)基
嚴格意義上來說，個性化細胞培養(yǎng)基不在細胞培養(yǎng)基的傳統(tǒng)分類之列，其具體是指一類根據(jù)細胞特性、細胞培養(yǎng)工藝特點、使用者需求習慣而量身定制的細胞培養(yǎng)基，主要目的是提高細胞產(chǎn)率、產(chǎn)品質(zhì)量、產(chǎn)品安全性和降低血清的使用等。個性化細胞培養(yǎng)基可能是無血清培養(yǎng)基，也可能是低血清培養(yǎng)基，終是為滿足某一種或某一類生物制品的生產(chǎn)需求。
培養(yǎng)基的基本組分細胞培養(yǎng)基必須含有充分的營養(yǎng)物質(zhì)，才能滿足新細胞合成、細胞代謝等生化反應(yīng)所需要的物質(zhì)和能量。細胞培養(yǎng)基的主要成份是水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助營養(yǎng)物質(zhì)等。此外，還可能含有血清、血清替代成分、pH指示劑等。
2.1 水
水是細胞的主要成份，也是細胞賴以生存的主要環(huán)境。細胞培養(yǎng)液中90 %以上的成份是水。細胞對水的品質(zhì)非常敏感，水的品質(zhì)將直接影響細胞培養(yǎng)的效果。而水中通常含有重金屬、氯、磷、有機物、熱原等污染物，細胞培養(yǎng)用水須經(jīng)過純化，品質(zhì)應(yīng)符合中國藥典注射用水標準或者超純水的標準。
2.2 能源和碳源
能源和碳源是用于維持細胞生命和支持細胞生長，主要包括糖、糖酵解的產(chǎn)物和谷氨酰胺，其他氨基酸是次要的能源和碳源物質(zhì)。細胞能夠利用的糖類主要是六碳糖，目大多體外培養(yǎng)時選取葡萄糖作為細胞的主要碳源和能量來源，因此細胞培養(yǎng)基中基本都含有葡萄糖，含量一般為5～25 mmol/L。
在葡萄糖濃度較高時，細胞主要通過擴散作用吸收葡萄糖，細胞膜內(nèi)外的葡萄糖濃度梯度是細胞吸收葡萄糖的動力；在葡萄糖濃度較低時，主要由鈉離子推動的高親和性轉(zhuǎn)運過程使細胞攝取葡萄糖。葡萄糖進入細胞后參與糖酵解、核酸代謝、糖原合成、能量代謝以及一些氨基酸的合成。與體內(nèi)的能量供應(yīng)途徑不同，體外培養(yǎng)時，一定的濃度范圍條件下，葡萄糖主要經(jīng)糖酵解循環(huán)轉(zhuǎn)化成乳酸來為細胞提供能量。
2.3 氮源（氨基酸）
氨基酸在細胞內(nèi)的重要生理作用主要體現(xiàn)在以下幾個方面：
① 是蛋白質(zhì)的基本組成單位，用于合成蛋白質(zhì)和多肽；
② 可用于合成某些具有重要生理作用的含氮化合物，如核酸、尼克酰胺等；
③ 某些氨基酸還具有獨特的生理作用，如甘氨酸參與生物轉(zhuǎn)化作用，丙氨酸和谷氨酰胺參與細胞內(nèi)氨的運輸?shù)龋?br />
④ 可轉(zhuǎn)變成糖類和脂肪，參與氧化供能。
細胞所能利用的氨基酸是L型同分異構(gòu)體，D型氨基酸不能被利用。不同的細胞對氨基酸的需求各異，但有些必需氨基酸是細胞不能自身合成的，必須依靠外源的細胞培養(yǎng)液提供。其余非必需氨基酸，細胞可以自己合成，或通過轉(zhuǎn)氨作用由其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來，但是在細胞培養(yǎng)基中添加適當濃度的非必需氨基酸可以減輕細胞在合成方面的負擔，提高谷氨酰胺及其它必需氨基酸的利用率。
絕大部分細胞對谷氨酰胺有較高的要求，可能因其不僅是細胞的主要氮源，且可作為細胞生長的能源物質(zhì)和嘌呤、嘧啶核苷酸的體，另外還可直接作為細胞增殖和產(chǎn)物合成中的蛋白質(zhì)和多肽的組成成分。在缺少谷氨酰胺時，細胞會生長不良，甚至死亡。由于谷氨酰胺具有多種生理作用，體外動物細胞培養(yǎng)時需要大量谷氨酰胺，利用量常超過其他必須氨基酸利用量的總和。
2.4 維生素
維生素是維持細胞生長的生物活性物質(zhì)，在細胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用。維生素可分為水溶性和脂溶性兩類，水溶性維生素主要包括泛酸、維生素B12、葉酸、煙酰胺、吡哆醛、硫胺素、核黃素、維生素C、膽堿、肌醇等；脂溶性維生素主要包括維生素A、D、 E、K等；有的培養(yǎng)液中還直接采用ATP和輔酶A；大部分培養(yǎng)基中還有生物素。
許多維生素參與構(gòu)成各種酶的活性基團的成分，沒有它們，酶便沒有活性，代謝活動將無法進行。比如，泛酸可以在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)變成�；d體蛋白和輔酶（如輔酶A），參與糖類、脂類和蛋白質(zhì)代謝中的催化反應(yīng)；維生素B12則在細胞內(nèi)參與葉酸的合成和脂肪酸的合成等。不同配方的細胞培養(yǎng)基中維生素的濃度有較大差異。例如，DMEM培養(yǎng)基中維生素的含量約為MEM培養(yǎng)基的兩倍，其原因是一方面不同種類維生素的作用不同，另一方面不同種類的細胞對維生素的需求也可能有較大差異，相應(yīng)細胞培養(yǎng)基的配方中維生素的含量也可能不同。
2.5 無機鹽
無機鹽是細胞維持生命活動所不可缺少的營養(yǎng)成分，主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl－、PO43—、SO42—、HCO3－等，主要作用為維持細胞培養(yǎng)液滲透壓平衡，參與細胞的代謝活動。此外，通過提供鈉，K+和Ca2+，幫助細胞調(diào)節(jié)細胞膜功能。Na+是細胞外液中主要的陽離子，對維持滲透壓的恒定有決定性的作用，還與Cl－共同參與生物電活動、維持水平衡和酸堿平衡等。K+主要分布在細胞內(nèi)液，對于激活某些酶是必需的，并在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡上也有重要意義。Ca2+和Mg2+主要參與信號傳導(dǎo)、能量代謝、脂肪酸合成、核糖體穩(wěn)定和蛋白質(zhì)合成等多種生理作用。PO43－、SO42－、HCO3－是基質(zhì)所需陰離子，同時是細胞內(nèi)電荷的調(diào)節(jié)者。磷對于細胞的生長、代謝和調(diào)控都有重要的作用，含磷的化合物如核酸、磷脂、蛋白質(zhì)是構(gòu)成細胞的主要成分，ATP、ADP是能量生成、存儲和利用的不可或缺的化合物。
上述離子對于細胞的作用各有不同，它們共同構(gòu)成了細胞賴以生存的滲透壓、pH和電化學平衡的微環(huán)境，細胞對于某種元素的吸收利用會受到其它元素的干擾，例如培養(yǎng)基中過高的鈣離子濃度會使鎂和鋅的吸收利用受到干擾。因此，在保證培養(yǎng)基中上述離子濃度滿足要求以外，還需保證上述離子之間種類和比例的平衡。
此外，微量元素如鐵、鈷、鎳、硒、碘、銅、鋅、錳、鉻、鉬、氟等對于細胞生長代謝和產(chǎn)物合成都有促進作用。微量元素在細胞內(nèi)通常以與有機物結(jié)合的形式存在。其中鐵在細胞中參與氧的轉(zhuǎn)運；鈷是維生素B12的組成部分，參與葉酸的合成和脂肪酸的合成；鎳能夠激活脫氧核糖核酸酶、乙酰輔酶A合成酶等在細胞內(nèi)具有重要功能的酶，還具有穩(wěn)定核酸結(jié)構(gòu)的功能；亞硒酸鈉中的硒，作為谷胱甘肽過氧化物酶的輔基，具有抗過氧化物能力，參與消除細胞內(nèi)的脂肪酸過氧化物，提高細胞的生長速率和活性。
2.6 其他添加成分
在低血清、無血清細胞培養(yǎng)基中，為滿足細胞生長增殖需要，常常添加一些成份：蛋白質(zhì)、多肽、核苷、嘌呤、檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物、脂類、及一些血清替代因子等。其中蛋白質(zhì)具有重要的作用，動物細胞對許多物質(zhì)（難溶于水的離子或脂類物質(zhì)）的攝取需要借助蛋白質(zhì)的傳遞作用，如白蛋白、傳遞蛋白、貼壁蛋白等能夠攜帶脂肪酸、激素、礦物質(zhì)等促進細胞生長。轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種重要的傳遞蛋白，能夠結(jié)合鐵，促進細胞對鐵離子的吸收，并具有解毒作用，其促生長作用可能與其具有生長因子的功能有關(guān)。胰島素可促進細胞對葡萄糖和氨基酸的利用，商業(yè)化中一些生長因子以重組蛋白形式添加到培養(yǎng)基中，主要用來刺激細胞增殖，并可促進糖元和脂肪酸的合成。乙醇胺是一種重要的刺激細胞生長的化合物，是腦磷酸的合成提。
另外，酚紅作為pH值的指示劑被加入到細胞培養(yǎng)基中。酚紅在產(chǎn)物純化過程中會造成干擾，并且具有一定的固醇類激素樣作用，如雌激素樣作用。當用于哺乳類動物細胞的培養(yǎng)，可能會發(fā)生一些固醇類反應(yīng)�，F(xiàn)在商業(yè)化細胞培養(yǎng)基中的酚紅含量可根據(jù)需求調(diào)整。因生物反應(yīng)器具有pH在線檢測技術(shù)，生物反應(yīng)器培養(yǎng)動物細胞時，酚紅可完全去除。
2.7 保護劑
細胞保護劑是保護細胞免受滲透壓變化、剪切力、氧化及氣泡作用等引起的損傷的物質(zhì)。在使用生物反應(yīng)器培養(yǎng)動物細胞時，細胞易被機械攪拌和通氣鼓泡產(chǎn)生的流體剪切力和氣泡作用所傷害甚至破損死亡。為降低這種損傷，除優(yōu)化生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)工藝外，可在細胞培養(yǎng)液中添加一些保護劑。其主要是通過改變細胞培養(yǎng)基物性或是對細胞具有保護作用的物質(zhì)，常用的種類有血清、白蛋白、聚已二醇（PEG）、非離子性表面活性劑PluronicF68或是其他一些高分子聚合物等。
客服一
