什么是IF（免疫熒光）染色？免疫熒光（IF）是一種用于檢測以及識別細胞和組織中蛋白質(zhì)和其他分子的亞細胞分布和遷移的強大檢測技術(shù)。IF可用作免疫組織化學(xué) (IHC) 或免疫細胞化學(xué) (ICC) 中使用的傳統(tǒng)顯色標(biāo)記的替代物。通過使用多種標(biāo)記物的二
抗體，可以研究感興趣蛋白的共定位，這是不能通過常規(guī)IHC或ICC實現(xiàn)。這是同時分析許多目標(biāo)蛋白時的一個優(yōu)勢，可同時生成大量亞細胞定位的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。
什么時候使用IF？
1.IF是一個很好的檢測技術(shù)工具，用于研究感興趣的產(chǎn)物如分子、蛋白質(zhì)或糖蛋白的表達、定位、分布和遷移。
2.用作顯色標(biāo)記物的替代物，例如3,3 ＇-二氨基聯(lián)苯胺 (DAB) 。
IF與ICC和IHC的區(qū)別IHC和ICC使用的樣本類型不同。IHC利用通常冷凍或石蠟包埋的整個組織樣本。ICC指的是分離的或培養(yǎng)的細胞樣本。這兩種樣本類型都可以使用IF進行標(biāo)記檢測。直接法IF使用帶有偶聯(lián)熒光染料（共軛抗體）的一抗體。間接法IF需同時使用可結(jié)合靶標(biāo)抗原一抗和偶聯(lián)熒光染色的二抗。
優(yōu)化IF，以下IF實驗優(yōu)化小技巧可以節(jié)省您的時間和成本，從而避免浪費您的寶貴樣品。1. 設(shè)置對照：可以使用陽性和陰性對照來確定結(jié)果的準(zhǔn)確性，并幫助確定任何問題的來源。
2. 樣品和試劑的存儲：由于IF中所用抗體和實驗樣品的熒光性質(zhì)，因此必須適當(dāng)存儲。好將熒光抗體和經(jīng)過IF處理的樣品都保存在完全黑暗的環(huán)境中。使用琥珀色或鋁箔覆蓋抗體管。
3. 使用適當(dāng)?shù)墓潭▌喝┛捎糜跇?biāo)記膜結(jié)合抗原或細胞骨架抗原，并應(yīng)用于核蛋白或線粒體蛋白。醛固定后的樣本需要抗原修復(fù)和打孔滲透步驟才能正確檢測抗原。如果使用單克隆抗體推薦有機溶劑用于組織固定。甲醇適用于冷凍樣本的固定；丙酮固定對組織學(xué)保存效果較好。
4. 仔細選擇抗體：應(yīng)檢查所有抗體，無論是單克隆抗體還是多克隆抗體，以確保與目標(biāo)抗原具有高的親和力。所用的二抗必須與一抗兼容，比如使用抗小鼠二抗檢測小鼠來源的一抗。
5. 多色染色：好使用在不同物種中產(chǎn)生的一抗。如果使用間接檢測，請使用已預(yù)先吸附在檢測其他蛋白質(zhì)的一抗和二抗的種屬以及實驗樣品的物種中的二抗。這樣可以大程度地減少跨物種的反應(yīng)性和非特異性結(jié)合。所有二抗也應(yīng)在同一物種中產(chǎn)生，以大程度地減少交叉反應(yīng)。一旦確定抗體特異性，就可以同時或依次將目標(biāo)抗原與其抗體孵育，順序孵育往往會產(chǎn)生更好的結(jié)果。對于亞細胞靶標(biāo)的共定位或復(fù)染色，請選擇對細胞器標(biāo)記特異的抗體。
6. 決定直接或間接染色：兩種方法都有優(yōu)點和缺點，根據(jù)實驗需求選擇。使用這兩種方法，都應(yīng)該確保充足的洗滌以小化非特異性的結(jié)合。
7. 選擇沒有光譜重疊的熒光團：IF是一種很好的多路復(fù)用分析技術(shù)，測量如此多的參數(shù)，那么使用能夠提供可分辨信號的熒光團是很有必要的。
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